直鏈烷基苯磺酸鈉對小鼠精子成熟和生育能力的影響

竇曉衛，任春娥，柏宏偉，劉洪香，張安清

(濰坊醫學院，山東 濰坊 261042)

精子成熟是一個復雜的過程，在睪丸內生成的精子沒有良好的活動能力。在從睪丸向附睪的輸送過程中逐漸完成形態和功能的轉變，因此附睪是促進精子成熟、儲存的重要器官［1］。直鏈烷基苯磺酸鈉(linear alkylbenzene sulphonates，LAS)是合成洗滌劑的表面活性物質，其對睪丸結構和生殖能力的影響已有相關報道［2］，而亞慢性或慢性LAS染毒對哺乳動物生殖能力的影響卻鮮有報道，尤其是對精子成熟過程及相關作用機制的研究甚少。本實驗采用昆明雄系小鼠作為動物模型，觀察附睪頭和附睪尾精子的功能參數，結合與正常雌鼠交配后所生子代的情況，評價直鏈烷基苯磺酸鈉對小鼠精子成熟和生育能力的影響，為研究LAS 的生殖毒性機制提供相應的參考資料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 直鏈烷基苯磺酸鈉(LAS，C18，有效含量不低于95%，天津市科密歐化學試劑有限公司)，伊紅染液、蘇木素染液、二甲苯、中性樹膠等，WLJY 精子分析系統，YD－AB 型生物組織攤烤片機，BX41TF 光學顯微鏡，H－7500透射電鏡等。

1.2 實驗動物及染毒模型的建立 健康雄性昆明小鼠60 只，鼠齡4 周，體重29～34 g，隨機分為實驗組A (LAS 630 mg/kg)，實驗組B (LAS 315 mg/kg)，對照組C (生理鹽水)，每組20 只。實驗組小鼠經口攝入直鏈烷基苯磺酸鈉，每日1 次，連續染毒60 天，各組小鼠均常規飼養，光照10 h/d，自由飲食和飲水。雌鼠30 只，6～8 周齡，體重20～25 g，常規飼養1 周，用于與雄鼠的交配。

1.3 小鼠附睪精子參數的檢測 染毒60 天時，頸椎脫臼法處死小鼠，每組處死10 只，迅速解剖取附睪頭和附睪尾，分別置于1 mL 的生理鹽水中(37℃預熱)，孵育1 分鐘后，常規精液涂片，光學顯微鏡下至少觀察100 個精子，計數精子密度、活力及胞漿小滴率。應用改良的巴氏染色法進行精子形態學分析，計數精子畸形率，觀察精子畸形的種類。

1.4 小鼠附睪尾精子的透射電鏡觀察 常規方法制備小鼠附睪尾精子的透射電鏡切片［3］，觀察精子的超微結構。

1.5 小鼠的生殖能力試驗 經各組中未處死的雄鼠(n=10)，分別與正常雌鼠交配，雌雄比例為1∶1，自合籠后起每日觀察雌鼠陰栓，發現陰栓為懷孕的第1 天，計數孕鼠的比例，孕鼠常規飼養18 天后解剖，觀察胎鼠的情況。

1.6 統計學處理 所得結果采用SPSS17.0 統計軟件進行數據處理，組間比較進行單因素方差分析及q 檢驗，P ＜0.05 為有統計學意義。

2 結 果

2.1 LAS 對小鼠附睪頭和附睪尾精子各項功能參數的影響 對照組小鼠附睪尾精子多表現為快速向前運動，附睪頭精子運動相對微弱，多為原位擺動或緩慢轉動。和對照組小鼠相比，實驗組小鼠附睪頭和附睪尾精子密度、活力均顯著降低(P ＜0.001，P ＜0.05)，精子畸形率顯著升高(P ＜0.001)，且具有明顯的劑量效應關系(見表1－3)。對照組小鼠中附睪頭精子含胞漿小滴率為70.5%，附睪尾精子為29.9%;低劑量染毒組小鼠胞漿小滴率從附睪頭的72.7%降至附睪尾精子的41.6%，即有31.1%的胞漿小滴脫落;而精子胞漿小滴脫落的異常在高劑量染毒組小鼠中則變現的更為顯著，從附睪頭精子的79.8% 降到附睪尾精子的61.6%，即僅有18.2%的胞漿小滴脫落。見圖1。

表1 LAS 對小鼠附睪頭和附睪尾精子密度的影響(n=10，，×106/mL)

表2 LAS 對小鼠附睪頭和附睪尾精子活力的影響(n=10，，%)

表3 LAS 對小鼠畸形精子率的影響(n=10，，%)

2.2 LAS 對小鼠精子形態學的改變 光學顯微鏡下，對照組小鼠精子頭部呈鐮刀狀，尾部細長，附睪頭精子和附睪尾精子最明顯的形態學差異在于胞漿小滴，附睪頭精子含胞漿小滴者多，且多位于尾部頸段，使精子尾部明顯彎曲。實驗組小鼠附睪尾精子的胞漿小滴率明顯增加，且有多種頭部和尾部畸形，如雙頭、香蕉頭、斷尾等。透射電鏡下，對照組小鼠精子9 +2 結構清晰，尾部線粒體排列緊密，大小形態一致。實驗組小鼠精子的超微結構發生明顯變化，表現為尾部線粒體排列疏松、腫脹、空泡形成等一系列凋亡前征象，并具有明顯的劑量效應關系。

2.3 LAS 對小鼠生育能力的影響 經LAS 染毒后，低劑量組和高劑量組小鼠的生育能力均呈不同程度的下降，率的比較采用χ2檢驗，和對照組相比差異有統計學意義(P ＜0.05)，且呈現出效量效應關系。經解剖后發現實驗組孕鼠腹中死胎+吸收胎鼠比例明顯高于對照組(P ＜0.05)。

表4 LAS 對小鼠生殖能力的影響

3 討 論

附睪作為雄性哺乳動物的附屬性腺，是精子成熟、保護、運輸、貯存的重要部位。附睪上皮細胞的合成、分泌、轉運等功能使精子發生一系列結構和功能的改變，從而使精子獲得受精和運動能力［4］。本實驗觀察到經LAS 染毒后的小鼠精子活力顯著降低，提示小鼠的附睪功能受到不同程度的損害，使小鼠精子的運動能力下降。

精子在附睪中的成熟要經歷非常復雜的過程，其中最主要的變化時精子尾部的胞漿小滴和尾部的卷曲。正常情況下，伴隨著精子從附睪頭向附睪尾的移行過程中，胞漿小滴同時向尾部末端移動，至精子成熟時，胞漿小滴隨之消失［5］。在附睪頭部，精子尾部呈卷曲狀，隨著精子的轉運，尾部卷曲的精子數目逐漸下降，至附睪尾部時精子尾部變直。研究表明精子胞漿小滴貯留和附睪功能改變、生育力下降等有關［6］，主要原因是胞漿小滴貯留后改變了精子胞膜脂質組成和代謝而使精子破裂增加［7］。本實驗結果表明直鏈烷基苯磺酸鈉可以增加附睪尾部胞漿小滴的殘留率。另外，透射電鏡下發現，實驗組小鼠多見精子核空泡、頂體腫脹和線粒體排列紊亂等超微結構的變化，說明精子在附睪階段發生了降解性改變，可見LAS 導致精子的附睪成熟降低。

哺乳動物的生殖過程是從受精開始的，而受精能力的獲得是在附睪中完成的，本實驗中觀察到二個染毒劑量組小鼠仍然保持生育能力，但較對照組顯著下降，同樣可作為附睪功能減退的證據。直鏈烷基苯磺酸鈉屬于低毒化學物質，但其應用廣泛并缺乏最低安全劑量標準［8］。近年來，LAS 的生殖毒性已引起國內外學者的關注，研究表明LAS 可使生物體內抗氧化酶活性降低，誘發機體脂質過氧化作用，從而干擾細胞內的各種代謝活動，影響細胞的增值和分化［9］?，F今為止，在已婚夫婦當中，大于15%的夫婦正受著不孕癥的困擾，其中大于50%是由于男性因素引起［10－11］，本實驗的研究結果提示LAS 的廣泛使用可能會造成潛在的生殖健康危害。包括LAS 等在內的家用化學物品，在為人類帶來方便和潔凈的同時，造成了潛在的健康危害，構成了社會衛生和安全問題。因此，應加強對LAS 毒性作用機制的研究，為確定最低安全接觸量提供實驗依據。

總之，本實驗以LAS 染毒小鼠作為研究模型，以附睪內精子的各項功能指標作為研究內容，可見LAS 影響了小鼠的附睪成熟過程，并為尋找LAS毒性作用的睪丸后靶點提供一定的實驗依據。給予2 個不同劑量的LAS，高劑量組小鼠所受的影響最為顯著，此結果對男性生殖健康是有參考意義的。

圖2 正常精細形態 HE×400

圖3 胞漿小滴陽性精子形態 HE×400

圖4 正常精子尾部結構(EM，×20000)，線粒體排列緊密，結構清晰無空泡化現象

圖5 實驗組小鼠精子結構(EM，×20000)，胞漿內大量空泡形成，精子9 +2 結構不完整，線粒體數目減少，排列疏松

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