缺血預處理對兔脊髓缺血再灌注損傷水通道蛋白－4表達的影響

方 波 趙 曦 王 赫 孫學軍 馬 虹

（中國醫科大學附屬第一醫院麻醉科，沈陽 110001）

胸腹主動脈手術通常需要阻斷主動脈，造成脊髓缺血再灌注損傷，引起截癱［1］。盡管人們已做了大量研究來防治脊髓缺血，但至今仍未取得令人滿意的效果。如何提高脊髓自身的抗損傷能力引起了國內外有關學者的關注。缺血預處理（Ischemic precondi－tioning，IPC）是通過短暫缺血使該組織耐受隨后長時間缺血的現象。研究表明IPC能夠有效的保護缺血脊髓［2，3］。迄今為止，IPC治療脊髓缺血再灌注損傷的機制研究集中在熱休克蛋白合成［1］，腺苷［4］和?；撬後尫牛?］，增加局部血流［6］，激活神經營養因子［7］及抗凋亡［3］等方面。組織水腫是脊髓缺血再灌注損傷的主要繼發性病理改變。水通道蛋白－4（apuaporin－4，AQP－4）主要分布在中樞神經系統［8］，在腦和脊髓的許多生理及病理過程中發揮重要作用［9］。本研究擬探討IPC對兔脊髓缺血再灌注損傷后AQP－4表達的影響，闡明其脊髓保護的機制。

材料和方法

1.動物選擇及分組

成年日本大耳白兔72只，由中國醫科大學實驗動物中心提供，體重1.8－2.6kg。采用隨機數字表法，隨機分為3組（n＝24）：假手術組（S組）、脊髓缺血再灌注組（I/R組）和缺血預處理組（IPC組），每組設兩個觀察時點，分別是損傷后4h和24h。S組打開腹腔暴露游離腎下腹主動脈，但不阻斷；I/R組阻斷腹主動脈30min造成脊髓缺血再灌注損傷；IPC組短暫阻斷腹主動脈5min，灌注10min，再阻斷5min，灌注25min實施預處理，之后阻斷腹主動脈30min造成缺血再灌注損傷。

2.脊髓缺血再灌注模型的建立

兔耳緣靜脈注射20%烏拉坦（1g/kg）麻醉，保留自主呼吸。耳緣中動脈置管測量近端動脈血壓，股動脈置管測量遠端血壓。直腸內置入溫度傳感器，持續監測體溫，應用電熱毯維持核心溫度38℃左右。腹部皮膚剪毛后消毒，取腹正中切口，沿腹白線0.25%布比卡因局部浸潤，剪開腹壁肌肉，暴露左腎及腹主動脈，用組織鉗鈍性分離左腎下腹主動脈。全身肝素化（200U/kg）后，腎動脈下1cm處用無損傷動脈夾阻斷腹主動脈30min，以遠端平均動脈壓（MAP）低于20mmHg為完全阻斷的標準。之后撤動脈夾開放腹主動脈，造成脊髓缺血再灌注損傷。之后絲線縫合，回籠飼養。

3.神經運動功能評價

以改良的Tarlov評分標準對下肢運動功能進行評價。評分標準：0分，沒有可覺察的下肢活動；1分，有可覺察的關節自主活動；2分，后肢可自由活動但無法站立；3分，可站立但無法行走；4分，后肢功能完全恢復，能正常行走。

4.脊髓水腫測定

采用干濕法測定脊髓含水量，評價脊髓水腫。分別取新鮮脊髓缺血節段（L4－6）標本用濾紙吸除表面水分后，置于電子天平稱取濕重 （W），再經110℃恒溫烤箱烘烤24h后稱取干重（D）。應用公式：脊髓含水量 （%）＝ （W－D）/W×100，計算脊髓含水量。

5.脊髓組織AQP－4表達的測定

取脊髓缺血節段，以10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片。每個標本隨機選取12張切片，進行免疫組化檢測。一抗為兔抗AQP－4多克隆抗體，由北京博奧森生物技術有限公司提供。Olympus光學顯微鏡下觀察染色積分光密度（integrated optical density，IOD），取均值為該樣本脊髓的 AQP－4染色IOD。

6.統計學處理

采用SPSS 13.0統計學軟件進行分析，數據以±s表示，統計學處理采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.神經運動功能評分

動物均于術后2h內蘇醒，各組分別于脊髓缺血再灌注損傷后4h和24h按照Talov評分進行評估。與S組相比，I/R組和IPC組損傷后4h和24h Talov評分組均明顯降低（P＜0.01），與I/R組相比IPC組損傷后4h和24hTalov評分均增高（P＜0.01），見圖1。

圖1 各組脊髓缺血再灌注損傷后4h、24h神經運動功能評分（n＝12）Fig.1 Tarlov score at 4hand 24hafter spinal ischemiareperfusion injury（±s，n＝12）＊P＜0.01vs S group，＃P＜0.01vs I/R group

2.脊髓含水量

脊髓缺血再灌注損傷后4h脊髓含水量即有明顯增加（P＜0.01），24h增加更多（P＜0.01）；與I/R組相比，IPC組損傷后4h和24h脊髓含水量均明顯減少（P＜0.05），見表1。

表1 各組脊髓缺血再灌注損傷后4h、24h脊髓組織含水量（n＝6，±s）Table1 Spinal water content at 4hand 24hafter spinal ischemia－reperfusion injury（n＝6，±s）

表1 各組脊髓缺血再灌注損傷后4h、24h脊髓組織含水量（n＝6，±s）Table1 Spinal water content at 4hand 24hafter spinal ischemia－reperfusion injury（n＝6，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs S group，＃＃P＜0.01vs I/R group

S I/R IPC 4h61.84±1.52 68.95±1.84＊＊ 64.15±1.59＊＃＃24h61.65±1.13 75.12±2.47＊＊ 67.92±1.76＊＊＃＃

3.脊髓組織中AQP－4表達

AQP－4主要分布在毛細血管周圍的星型膠質細胞膜表面及終足上，還見于軟脊膜細胞，脊髓中央管的室管膜細胞表面。脊髓損傷后4hAQP－4IOD較假手術組顯著增加（P＜0.05），24h增加更顯著（P＜0.01）；與I/R組相比，IPC組損傷后4h和24h AQP－4IOD明顯減少（P＜0.01），見圖2。

圖2 各組脊髓缺血再灌注損傷后脊髓組織AQP－4表達（n＝6，±s）。（A）脊髓組織AQP－4免疫組化染色。a：S組（×100）；b：S組（×200）；c：I/R組24h（×100）；d：I/R組24h（×200）；e：IPC組24h（×100）；f：IPC組24h（×200）；g：S組全景分布（×25）。（B）AQP－4染色IOD值。Fig.2 AQP－4expression at 4hand 24hafter spinal ischemia－reperfusion injury（n＝6，±s）.（A）Representative immunostaining of AQP－4in spinal cords.a：S group（×100）；b：S group（×200）；c：I/R 24h（×100）；d：I/R 24h（×200）；e：IPC 24h（×100）；f：IPC 24h（×200）；g：distribution of overall view in S group（×25）.（B）Quantitative analysis of AQP－4IOD.

討 論

脊髓缺血再灌注損傷是去除導致脊髓缺血的因素后，脊髓恢復血供，但神經功能不僅沒有改善，反而在原來缺血損傷的基礎上進一步加重，甚至出現不可逆性脊髓神經元遲發性死亡的現象［10］。缺血/再灌注損傷機制十分復雜，雖然有些藥物或處理措施對實驗動物有效，但能成功應用于臨床的仍然很少。自從IPC應用于心肌保護，很多學者致力于研究IPC在中樞神經系統中的保護作用。IPC包括早期預處理和延遲預處理兩種保護作用。早期IPC是在短暫缺血后幾分鐘至幾小時內提高缺血耐受性，而延遲IPC則是在短暫缺血后一天或幾天發揮有益的作用。本研究發現IPC在脊髓缺血再灌注損傷后4h和24h抑制AQP－4表達，減輕脊髓水腫，并改善神經功能，可能是分別通過早期保護和延遲保護的作用機制。

水通道蛋白（apuaporins，AQPs）是近十余年來發現的一組膜通道蛋白，廣泛存在于各種生物的細胞膜上，介導水分子的跨膜轉運，調節血腦屏障對水分子、K＋的通透和神經細胞外間隙的大小。其中，AQP－4在中樞神經系統損傷后血腦屏障的破壞和組織水腫的形成過程中起重要作用，而它的缺失可減輕水中毒和局部缺血所引起的水腫癥狀［11］。研究表明各種大腦損傷都導致損傷區膠質細胞AQP－4mRNA的高表達，加重損傷區及其周圍部位水腫［12］，而 AQP－4表達的下調可在滲透壓梯度和靜水壓促進水進入腦實質時降低血腦屏障對水的通透性，防止腦水腫的發生［13，14］。研究發現脊髓損傷后1dAQP－4及其mRNA表達開始增加，脊髓損傷后3d達高峰，相應的水腫形成［15］，因此推斷AQP－4表達增加可能是促使脊髓組織水腫發生的重要因素之一。但也有研究持相反的觀點，Joshi等［16］認為脊髓損傷時血管性水腫是過多的水分可能通過受損的血脊髓屏障進入細胞外間隙，而不依賴AQP－4。本研究采取經典的阻斷腹主動脈的方法制備脊髓缺血再灌注損傷模型，結果表明脊髓缺血再灌注損傷后AQP－4表達增加，脊髓出現水腫，神經功能降低，相比之下IPC組AQP－4表達增加受到抑制，脊髓水腫減輕，神經功能改善。其他的研究［17－19］同樣發現應用骨髓間充質干細胞和嗅鞘細胞移植或中藥治療脊髓損傷也可通過抑制AQP－4表達，消除脊髓水腫，減輕脊髓繼發性損傷，從而保存殘存的脊髓組織并促進脊髓功能恢復，支持本研究的結果。

綜上所述，IPC能通過抑制脊髓損傷后AQP－4的表達，減輕脊髓損傷部位水腫、減輕脊髓缺血再灌注損傷，這可能是IPC脊髓保護的機制之一。

［1］Coselli JS，LeMaire SA，Miller CC，et al.Mortality and paraplegia after thoracoabdominal aortic aneurysm repair：a risk factor analysis.Ann Thorac Surg，2000，69（2）：409－414

［2］Kyrou IE，Papakostas JC，Ioachim E，et al.Early ischaemic preconditioning of spinal cord enhanced the binding profile of heat shock protein 70with neurofilaments and promoted its nuclear translocation after thoraco－abdominal aortic occlusion in pigs.Eur J Vasc Endovasc Surg，2012，43（4）：408－414

［3］Yang C，Ren Y，Liu F，et al.Ischemic preconditioning suppresses apoptosis of rabbit spinal neurocytes by inhibiting ASK1－14－3－3dissociation.Neurosci Lett，2008，441（3）：267－271

［4］Zvara DA，Colonna DM，Deal DD，et al.Ischemic preconditioning reduces neurologic injury in a rat model of spinal cord ischemia.Ann Thorac Surg，1999，68（3）：874－880

［5］Miyamoto TA，Miyamoto KJ.Mechanisms of acute ischemic preconditioning.Ann Thorac Surg，2000，70（6）：2186

［6］Ueno T，Chao ZL，Okazaki Y，et al.The impact of ischaemic preconditioning on spinal cord blood flow and paraplegia.Cardiovasc Surg，2001，9（6）：575－579

［7］Wick A，Wick W，Waltenberger J，et al.Neuroprotection by hypoxic preconditioning requires sequential activation of vascular endothelial growth factor receptor and Akt.J Neurosci，2002，22（15）：6401－6407

［8］Frigeri A，Gropper M A，Umenishi F，et al.Localization of MIWC and GLIP water channel homologues in neuromuscular，epithelial and glandular tissues.Cell Sci，1995，108（9）：2993－3002

［9］Rash JE，Yasumura T，Hudso n CS，et al.Direct immunogold labeling of aquaporin－4in square arrays o f astrocyte and ependymocyte plasma membranes in rat brain and spinal cord.Neurobiology，1998，95（20）：11981－11986

［10］王鵬，殷國勇，曹曉建.脊髓缺血－再灌注損傷機制及防治措施研究進展.醫學綜述，2006，12（20）：1256－1258

［11］Verkman AS，Yang B，Song Y，et al.Role of water channels in fluid transport studied by phenotype analysis of aquaporin knockout mice.Exp Physiol，2000，85：233－241

［12］Vizuete ML，Venero JI，Vargas C，et al.Differential up－regulation of aquaporin－4mRNA expression in reactive astrocytes after brain iniury：potential role in brain edema.Neurobiol Dis，1999，6（4）：245－258

［13］Ke C，Poon WS，Ng HK，et al.Heterogenous responses of aquaporin－4in edema formation in a replicated severe traumatic brain injury model in rat.Neurosci Lett，2001，301（1）：21－24

［14］Kiening KL，Landeghem FK，Schreiber S，et al.Decreased hemispheric aquaporin－4is linked to evolving brain edema following controlled cortical impact injury in rats.Neurosci Lett，2002，324（2）：105－108

［15］王偉，謝杰，方堅等.水通道蛋白－4在實驗性脊髓損傷大鼠的表達.神經解剖學雜志，2005，21（2）：139－142

［16］Joshi M，Fehlings MG.Development and characterization of a novel，graded model of clip compressive spinal cord injury in the mouse：Part 2.Quantitative neuroanatomical assessment and analysis of the relationships between axonal tracts，residual tissue，and locomotor recovery.J Neurotrauma，2002，19（2）：191－203

［17］吳碧蓮，賈小力，陳少強.靜脈注射骨髓間充質干細胞可抑制大鼠損傷脊髓水通道蛋白－4的表達.解剖學雜志，2008，31（5）：691

［18］彭忠勇，陳志斌，修波等.嗅鞘細胞移植對大鼠脊髓損傷后水通道蛋白－4的影響.貴陽醫學院學報，2009，34（4）：378－381

［19］王偉，謝杰，方堅等.補陽還五湯對實驗性脊髓損傷大鼠水通道蛋白－4表達的影響.中國康復，2005，20（1）：3－5