芽胞結構的研究進展

紀 芳，梁 勇

（江漢大學 醫學院，湖北 武漢 430056）

在遭遇逆境時，多數細菌都能以某種程度停滯生長，以等待合適條件的來臨，最常見的如芽胞桿菌屬Bacillus spp.和梭狀芽胞桿菌屬Clostridi?um spp.，其在營養受限的條件下可以產生芽胞。芽胞是一種休眠形式的細胞，能抵抗多種不利條件而存活下來，比如高溫、高寒、高壓、放射線、營養缺乏、殺菌劑等，少數甚至能耐受外太空的惡劣條件，一些芽胞在歷經數百萬年以上仍能保持休眠狀態。當環境條件改善時，休眠芽胞就會活化、萌發并且脫出外殼，細胞體積迅速增大，形成營養體細胞，緊接著以二分裂的方式進行營養期繁殖。芽胞的高度抗逆性提高了細菌的存活力，但給食品工業帶來了麻煩，也是導致患者腹瀉的重要原因［1］。

芽胞具有高度的抗逆性，學者們對芽胞的結構和組成有著濃厚的興趣，開展了大量的研究工作。目前對芽胞的了解主要來自于芽胞桿菌屬，筆者對芽胞結構的研究進展進行綜述。

1 芽胞的主要結構

芽胞有一些保護性構造，形成一系列同心的殼層，每一層都對芽胞的耐受力起著不可缺少的作用，其結構如圖1所示。常以枯草芽胞桿菌Bs（Bacillus.subtilis）為模式菌對芽胞進行研究，其芽胞從內至外可分為芽胞內核、芽胞皮層、芽胞衣3層結構。而很多其他芽胞桿菌特別是蠟狀芽胞桿菌Bc（Bacillus.cereus）在芽胞衣外還有一層被稱為芽胞外壁的松散泡狀結構，如圖2［2］所示。

圖1 芽胞的結構圖

圖2 金屬投影法掃描電鏡觀察Bc的芽胞

1.1 芽胞內核

芽胞內核由一層薄膜包裹，里面含有與酸溶性蛋白質結合的DNA、蛋白質、RNA、脂類、核糖體、酶，少量的糖和鹽類［3］。內核的含水量很低，只有28%～57%，有助于抵抗高溫和化學物質［4］，很好地保護了DNA。

1.2 芽胞皮層

芽胞皮層較厚，含黏性復合物。主要成分為肽聚糖，與營養體細胞的肽聚糖相似，但結構松散，肽聚糖的交聯程度很低，且不含營養體細胞的多聚糖磷壁酸。皮層維持著芽胞內核的形態，使其保持干燥狀態并具耐熱性能［5］。

1.3 芽胞衣

芽胞衣是一種緊密覆蓋在皮層外的多層次蛋白質結構，其層次數量和表面形態的復雜性依種的不同有明顯差異［1］。傳統上，Bs的芽胞衣可分為兩層：一個染色較深的外層和一個染色較淺的內層。外層由交叉的桿狀物組成，內層由六角形的穿孔物組成，孔位于六角形的中央，并常有一等同直徑的顆粒狀填充物。最近一項精細的研究把Bs的芽胞衣結構根據蛋白的種類分為4層［6］。

芽胞衣的大部分成分是蛋白質，含少量的糖類（6%）。最近一項研究［7］發現，在芽胞桿菌的芽胞衣里還沉積著一層硅元素，可以提高芽胞的抗酸性。硅元素在土壤和水中是天然存在的，這意味著細菌可以自然地攝入硅。當細菌遇到酸性環境時，比如動物的胃液，芽胞中沉積的硅鹽層將有助于細菌的存活。

芽胞衣形態學上的復雜性反映了其蛋白質組成的復雜性。目前已經發現了超過70種芽胞衣蛋白［6］，學者們對其中一些已做了精細的分析［8-10］。芽胞衣蛋白有可溶性和不可溶型兩類，前者大概占70%。不可溶的芽胞衣蛋白多具有二硫鍵，其他的交聯方式包括二酪氨酸的交聯和賴氨酸的交聯。芽胞衣的化學性質和抗性機制很可能與蛋白質的重度交聯有關。組成芽胞衣的蛋白中既有結構蛋白，也有起控制裝配作用的蛋白。在實驗室條件下研究發現，大多數芽胞衣蛋白對于發揮芽胞衣的屏障功能無關緊要，因為缺失其中任何一個基因都檢測不到異常。但是兩個關鍵的蛋白除外，即SpoIVA和CotE。SpoIVA位于芽胞衣和皮層之間，將芽胞衣與芽胞表面相連接，如果沒有SpoIVA，芽胞衣可以形成，但不能附著于芽胞。CotE則定位于外芽胞衣和內芽胞衣之間的交界面，它負責整個外芽胞衣以及幾個內芽胞衣蛋白的裝配。另外有幾種蛋白也有介導裝配的功能，研究較多的是SpoVID和SafA，它們在芽胞裝配的早期發揮一定的作用。研究表明，SpoVID和CotE在芽胞衣的形成過程中直接發生相互作用［11］。在Bs中，對芽胞衣裝配起關鍵作用的蛋白質通常也影響萌發。一項研究［6］結果顯示，大多數芽胞衣蛋白在一個主要的與形態發生有關的蛋白質的控制下進行裝配。

1.4 芽胞外壁

與Bs不同，Bc和其他一些種在芽胞衣外多了一層芽胞外壁。芽胞外壁不與芽胞衣直接相連，中間被暫名為衣壁空間（interspace）的區域隔開，如圖1所示。處于衣壁空間中物質的性質仍然未知。芽胞外壁對芽胞抗性所起的作用還未見報道，它在諸如Bs等一些種中是缺乏的，而這些菌種同樣能經受環境壓力?？赡苎堪獗谠谔厥獾男∩郴蛏芷谥屑胺且话阈缘谋Ｗo或萌發中發揮一定的作用。因為芽胞研究的模式菌Bs缺乏芽胞外壁，所以對芽胞外壁的研究尤其在分子細節方面相對較薄弱。

Bc的芽胞外壁比較相似，在電子顯微鏡下觀察可分為兩層，內層為基質層，外層為著生在基質層上的絨毛樣層（如圖3［12］所示）。芽胞外壁含有蛋白質、脂類和糖類物質，各占干重的43%～52%、15%～18%以及23%。

如前文所述，因為研究芽胞發育的模式菌Bs沒有芽胞外壁，所以對芽胞外壁的研究在分子水平上與芽胞衣相比相對不足。近年來不斷發生的恐怖襲擊活動，使人們對生物武器有了更多的關注，從而也加強了研究相關細菌及其芽胞的緊迫性。最近的研究主要集中在炭疽芽胞桿菌Ba（Bacillus anthracis）芽胞和哺乳動物免疫系統之間的相互作用和發展更準確快捷的芽胞檢測手段。這兩方面的研究都需要清楚了解Ba芽胞的最外層即芽胞外壁的分子細節。因為這層囊泡樣的芽胞外壁是芽胞直接接觸外部環境或宿主細胞的部分。初步分析芽胞外壁至少含有12種不同的蛋白質和糖蛋白［13］。

圖3 芽胞外壁結構圖

現在已經在Ba芽胞外壁的絨毛層中鑒定出兩種糖蛋白：BclA和 BclB［14-15］，是主要結構蛋白。BclA在細胞中以糖基化形式存在，且具有一個CLR（collagen-like region，類似膠原蛋白的區域），這兩項特征在原核生物的蛋白質中都是罕見的。而另一種絨毛樣外層的結構蛋白BclB，也是一種類似膠原蛋白的糖蛋白，與BclA相比含量較少，但對芽胞外壁結構的裝配與保持也起重要作用［14］。

芽胞外壁的基質內層也由數種不同蛋白質所組成［13，16］。2005 年 C.T.Steichen 等［13］首先對其中的BxpB進行了深入研究，其結果顯示BxpB是基質層的組成蛋白之一，與BclA、潛在的基質層蛋白ExsY及其他幾種蛋白質一起組成一個穩定的復合體，并且它對BclA附著到芽胞外壁是必須的，還對芽胞的萌發有一定的抑制。bxpB基因缺失突變株的芽胞外壁雖然失去了絨毛樣外層，但基質層的外觀沒有明顯變化，說明是另外幾種蛋白質決定了基質層的外觀性質。2006年，M.J.Johnson等［17］以 B.cereus為 研 究 對 象 ，J.A.Boydston等［18］以B.anhracis為研究對象，分別發表論文闡述了基質層中的另一種蛋白質ExsY于芽胞外壁形成中所起的作用。兩人的研究結果都顯示ExsY對于芽胞外壁的正常裝配是不可缺少的。如果exsy缺陷，則在液體培養基中產生的芽胞會失去芽胞外壁，在固體培養基中的芽胞僅在一極具有帽子樣的芽胞外壁片段。2011年又定位了一種基質層蛋白BetA，也具有類似膠原的結構域，與芽胞外壁的組裝有關［19］。

多位學者的研究都顯示芽胞外壁不正?；蛲耆笔У腂a突變株其原有的毒力不受影響，說明芽胞外壁與病原菌的致病性無關，但仍然對芽胞有其他影響，比如導致萌發效率下降等。弄清楚芽胞外壁在芽胞的抗性、致病性以及在環境中的維持能力方面所起的作用是未來研究的一個重要方向。

2 芽胞的其他特殊構造

對芽胞桿菌屬中的蘇云金芽胞桿菌Bt（Bacil?lus.thuringiensis）來說，芽胞的形成是其正常生活周期的一個階段，而不僅是對不良環境的簡單反應［20］，其完整生命循環包括營養體細胞和芽胞的交替形成。Bt在芽胞形成的過程中會形成一種特殊成分，稱為伴胞晶體，是一類毒殺昆蟲的活性物質，能夠在昆蟲堿性的腸道中溶解致昆蟲死亡。由于這類伴胞晶體能高效殺蟲且對人畜無毒，現已成為生物農藥的主要成分之一。

不同Bt的伴胞晶體在大小、形狀和數量上各有差異。晶體形成的位置通常有兩種，游離型和粘聯型。多數晶體形成于芽胞外壁以外，芽胞成熟時母細胞會破裂，釋放出游離晶體，稱為游離型（圖4A［21］）；少數形成于衣壁空間（interspace），芽胞成熟釋放后不與芽胞分離，稱為粘聯型（圖4B［21］），目前已有報道的有粘聯型晶體的菌種僅有近10種，如蘇云金芽胞桿菌幕蟲亞種幕蟲亞種B.thuringiensis subsp.finitimus和華中亞種B.thuringiensis subsp.huazhongensis。而通過基因克隆技術，一個細胞內甚至可以同時出現兩種晶體，如圖 4C［21］所示。

圖4 芽胞與伴胞晶體的薄層透射電鏡照片

在某些Bt的芽胞外壁表面還出現單根菌毛結構，它由芽胞外壁底部伸出，鄰近伴胞晶體，如圖5［22］所示，且在芽胞萌發為營養體時也會繼續附著在細胞上。

而在不產晶體的Bc的芽胞外壁內側也可經?？吹奖∑瑯拥牟贿B續的伴胞包涵體，如圖6［2］中箭頭所指，其成分和功能尚有待進一步研究。

3 芽胞的動態變化

圖5 有菌毛結構的蘇云金芽胞桿菌Bt2-56的電子顯微鏡照片

圖6 Bc的完整芽胞的透射電鏡照片

芽胞保護性構造的一個最關鍵的功能就是牢牢鎖住DNA，使其保持一種穩定干燥的結晶態，將其與有害分子隔離開。芽胞的這種休眠特性，以及干燥堅硬以保護DNA的特點很容易讓人以為它是非常穩固的，沒有可運動變化的部分?？墒?，研究發現Bt芽胞的大小能根據相對濕度的變化發生明顯改變，如圖7所示，其改變幅度甚至可達到平均30%。而相對濕度是芽胞存在的自然環境如土壤中最易改變的一個參數。前面已提到，芽胞皮層主要是松散交聯的肽聚糖，其交聯程度是可以發生變化的。這種變化能改變皮層的彈性，同時改變其膨脹或收縮以應對離子濃度變化的能力。而在以前，這種變化被認為是芽胞核脫水所致。Dricks等在用原子力顯微鏡AFM對芽胞進行觀察時，發現芽胞衣呈現出眾多的嵴狀突起，如圖8［23］所示，這正是芽胞衣折疊的表現。這種折疊說明了芽胞衣還有相當大的膨脹擴展空間，以適應于不同的濕度環境和芽胞萌發。在環境濕度和溫度恒定的條件下測量芽胞的大小，或觀察比較芽胞表面嵴狀突起的差異，可以作為區分不同種的參考依據。

4 結語

圖7 相對濕度的變化引起芽胞形態變化的結果

圖8 對B.subtilis芽胞的AFM分析照片

芽胞是很多細菌在不利環境條件下產生的休眠體，能夠抵抗多種極端的環境壓力，在保存自身、頑強存活的同時，也給人類的生活和健康帶來了不利的影響。芽胞強大的耐受能力顯然與其特殊的構造有關。芽胞的結構一般可分為內核、皮層、芽胞衣這3個大的層次，有的在芽胞衣外還有一層芽胞外壁。每一層結構的形成與裝配都受到嚴格的調控。通常認為主要由前3種的特殊組成和性質來提供芽胞的抗逆性。但是對于一些病原菌來說，芽胞外壁是其與宿主直接接觸的部分，因此也得到學者們的關注。

對芽胞的研究不僅有助于消除芽胞的抗逆性帶來的不利影響，同時芽胞作為一種研究細胞復雜結構的裝配與調控的理想模型，也具有重要的理論研究意義。

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