抗環瓜氨酸肽抗體檢測新進展

趙瀛 黃斐 宋斌斌 郭瑋 潘柏申

(復旦大學附屬中山醫院檢驗科，上海 200032)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種病因不明的系統性慢性自身免疫性疾病，主要臨床特征為對稱性、反復性多滑膜關節炎，最終可導致不可逆的骨關節損傷。RA的早期診斷、治療對提高患者的生活質量和生存率有重要意義。1987年美國風濕病協會(American Rheumatism Association，ACR)首次制定了RA的診斷標準，包括臨床表現、影像學特征以及類風濕因子(rheumatoid factor，RF)測定等方面，但是，RA患者在達到該標準時可能早已發生骨關節損傷。此外，RF也可見于其他自身免疫性疾病、慢性感染患者或老年人的血清中，因此其用于診斷RA的特異性較差。2009年ACR和歐洲抗風濕病聯盟(The European League Against Rheumatism，EULAR)提出，將抗環瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptide，CCP)抗體納入RA的新的診斷標準中。

抗-CCP抗體是由RA患者的B淋巴細胞分泌的一種特異性較高的自身抗體，不僅可作為鑒別診斷RA與其他風濕病所致關節炎(痛)的指標[1-3]，還可作為判斷RA患者骨關節損傷程度以及評估療效的指標[4-5]。目前，在抗-CCP抗體的靶抗原、包被方式和固相載體、檢測技術等方面都有了長足發展。

1 抗-CCP抗體特異性靶抗原

1998年，Schellekens等[6]研究發現，RA患者血清中的瓜氨酸肽是與自身免疫抗體結合的最主要的抗原決定簇，且聚角蛋白中富含的精氨酸的羧基端具有抗原性。由此，研究人員從人工合成的氨基酸序列中篩選出線性多肽，以此作為靶抗原。該靶抗原序列已知，可大量合成并純化，而且分子量較小，與血清中其他成分的非特異性反應較少。但是，此類靶抗原的線性構象不穩定，可能產生“構象稀釋”效應，導致檢測結果偏低。

在抗原抗體復合物中，抗原肽常常以β-轉角的構象形式存在。2000年，Schellekens等[7]以胱氨酸替代絲氨酸作為橋聯介質，使線性瓜氨酸肽環化即轉化為CCP，以此模仿自然的抗原決定簇，使其在溶液中的構象更為穩定；隨后，他們通過Fmoc化學法固相合成含21個氨基酸序列的CCP，即第1代CCP(CCP1)，以CCP1作為靶抗原，采用酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測RA患者血清中的抗-CCP抗體；結果發現，與線性瓜氨酸肽比較，CCP診斷RA的靈敏度提高(68% 比 49%)，特異度為98%，但是CCP的靈敏度較RF略低[8]。2002年第2代CCP(CCP2)問世，CCP2是從RA患者的血清環瓜氨酸庫中篩選出的不同系列、反應性較好、模擬真實構象的抗原肽[9]。CCP2的檢測性能較CCP1好，CCP2診斷RA的靈敏度為64.4%～96%，已成為臨床實驗室中較為常用的抗原肽之一[10]。ELISA法檢測顯示，CCP2的診斷靈敏度(67.4%)高于CCP1(46.5)[11]。van Gaalen等[9]發現，CCP2不僅可用于診斷早期RA，還可以預測RA患者關節損傷的進展。CCP3是一種重組多肽，包含多種構象的瓜氨酸表位，從而增加了暴露位點，提高了對早期RA的免疫反應性[12]。dos Anjos等[13]對同一廠家生產的第2、3代抗-CCP抗體比較后發現，CCP3的診斷特異性與CCP2相似，但診斷靈敏度(82.9%)略高于CCP2(78.6%)。但是，也有文獻[14]報道，Inova公司的CCP3與其他公司的CCP2相比并無明顯優勢，這可能與各廠家所用的抗原肽純化技術不同而導致暴露的抗原決定簇存在差異有關。

2 包被方式和固相載體

固相化方式以及固相載體材料的選擇對于抗原抗體的反應速率、洗滌分離以及靈敏度和線性范圍的檢測等具有重要意義。

2.1 包被方式 鏈霉親和素包被一直是臨床最常用的非共價包被方式。鏈霉親和素與生物素間具有很強的結合能力，一個鏈霉親和素可結合4個生物素分子，對目的分子的檢測信號有放大作用。房國祥等[15]在ELISA的基礎上建立了生物素-鏈霉親合素系統檢測抗-CCP抗體的方法，鏈霉親和素預包被(SA/Bio-CCP)的固相化模式對RA的診斷靈敏度和特異度分別為69.4%和96.8%。由于鏈霉親和素屬于堿性糖蛋白，分子量較大，易與聚苯乙烯塑料微孔板表面結合，故鏈霉親和素包被CCP不僅易將分子量較小的CCP固定于微孔板上，而且減小了反應過程中的空間位阻。但是，在這種非共價固相方式中，CCP的吸附較隨意，且在吸附過程中CCP的分子結構可能發生改變，使功能部位無法暴露，影響CCP與抗體的結合。此外，由于CCP3為小分子多肽，其疏水區域極少，導致其不易充分吸附于SA/Bio-CCP模板的微孔上，易在洗滌過程中發生脫吸附現象。共價耦聯固相法可以解決上述問題，從而提高了檢測靈敏度。聚對二甲苯-H膜是甲?；揎椀膶Χ妆降木酆衔?，可以與蛋白質或多肽的伯胺基團反應，形成共價連接，其與CCP一步孵育后，二者可共價連接[16]。共價耦聯法與非共價固相法的最低檢出限分別為0.1 ng/mL及100 ng/mL，共價耦聯法的固相化效率是非共價固相法的1000倍；根據兩者的截斷值(cut-off)，共價耦聯法的靈敏度和特異度均高于非共價固相法[17]。

2.2 固相載體 聚苯乙烯為ELISA檢測技術中的常用固相載體，這種固相載體材料的吸附表面平整，其包被和反應的表面積較小，使得抗原抗體的反應時間較長、檢測速度較慢、線性范圍較窄、易發生勾狀效應。同時，由于抗原肽包被于聚苯乙烯表面且每一個反應孔(杯)只能檢測一個固定項目，不利于高通量流水線自動化定量分析。因此，國內外開發了新型的固相載體材料來彌補以上缺陷，如表面微?；笜税?、磁性微球。

磁性微球是國外應用的主要固相載體，它是通過適當的方法使有機高分子與無機磁性物質結合而形成的具有一定磁性及特殊結構的微球；可以通過共聚、表面改性等化學反應方法在微球表面引入多種反應性功能基團，磁性微球也可通過共價鍵結合生物活性物質，同時在外加磁場作用下，表現出強烈的磁響應性，可以進行快速分離。因此，磁性微球作為固相載體，具有快速分離、反應表面積大以及接近均相反應的優勢，在一定程度上提高了檢測靈敏度和效率。

3 抗-CCP抗體檢測技術

隨著免疫學研究的進展，抗-CCP抗體的檢測技術也在不斷改進，由傳統的低通量、定性/半定量的檢測技術向高通量、定量的檢測技術發展，有效地提高了抗-CCP抗體的檢測效率、檢測性能以及臨床應用價值。

3.1 定性檢測技術

3.1.1 斑點免疫印跡法(dot immunobinding assay，DIBA) DIBA法是利用硝酸纖維素膜或乙酸纖維素膜作為固相支持物、進行抗原抗體反應的免疫學檢測方法。虞偉等[18]用DIBA法檢測抗-CCP抗體，并經方陣滴定法確定最佳實驗條件；他們發現，DIBA法與歐蒙ELISA法檢測結果的一致性尚可(Kappa=0.714)；DIBA法的特異度略高于ELISA法，但其靈敏度(52%)低于ELISA法(60.4%)，并且DIBA法檢測抗-CCP抗體的穩定性及重復性難以控制，檢測所需時間較長(2 h)。

3.1.2 膠體金免疫層析法(gold immunochromatography assay，GICA) GICA法是將膠體金標記技術、免疫檢測技術和層析分析技術等相結合的固相免疫檢測技術，其主要原理是將膠體金作為抗原示蹤標記物，對檢測樣本中抗體的性質、含量進行分析。研究[19]顯示，GICA法與歐蒙ELISA法對抗-CCP抗體的檢測結果一致(Kappa=0.92～0.93)，總符合率為96.0%～97.3%；GICA法的靈敏度(84%)及特異度(98%)均較ELISA法高，且該方法操作簡單，僅需5 min就可用肉眼觀察結果，可用于快速篩查；但是，GICA法在實際應用中易受反應溫度、濕度、加樣量等因素影響。

3.2 定量檢測技術 化學發光分析技術是臨床常用的定量檢測技術。該技術是將化學發光分析系統和免疫測定相結合而建立起來的一種痕量分析方法，因其具有靈敏度和特異度高、重復性好、檢測范圍寬、檢測時間短、易于自動化等優勢而成為臨床常用的檢測技術。目前，臨床上主要通過化學發光酶免疫測定技術(chemiluminescent enzyme immunoassay，CLEIA)和電化學發光免疫測定技術(electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA)檢測抗-CCP抗體。

3.2.1 CLEIA法 CLEIA法將堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶等標記的抗原與樣本中的抗體結合，加入發光劑，根據發光體系的發光強度進行抗-CCP抗體的測定。Tanaka等[20]采用CLEIA法與ELISA法檢測抗-CCP抗體，發現CLEIA法對抗-CCP抗體的最低檢測限為0.1 U/mL，為ELISA法的10倍；CLEIA法的整個檢測過程僅需45 min；CLEIA法檢測抗-CCP抗體的重復性、精密度、穩定性均優于ELISA法。近年來，有研究[21]評估了臨床常用的Abbott公司全自動化學發光微粒子免疫檢測法(chemiluminescent microparticle immunoassay，CMIA)對抗-CCP抗體的檢測，結果顯示，該方法的檢測范圍為0.95～194.6 U/mL；CMIA的受試者工作特征(receiver operator characteristic，ROC)曲線下面積大于ELISA法，有較好的診斷性能；CMIA的最適cut-off值所對應的診斷靈敏度與特異度分別為84.1%和94.2%，與ELISA法相比，其總體符合率達99.48%；此外，用CMIA法檢測抗-CCP抗體，可使其對RA的診斷性能優于RF或抗角蛋白抗體(anti-keratin antibody，AKA)等指標[22]。

3.2.2 ECLIA法 ECLIA法是用三聯吡啶釕標記抗原，通過抗原抗體反應和磁珠分離，檢測電極上三聯吡啶釕發光強度，以此定量檢測抗體。對ECLIA法的基本檢測特性的評估顯示，其批內和天間變異系數分別為0.9%～1.8%和1.7%～2.4%，回收率為96.7%～98.6[23]；ROC曲線分析顯示，ECLIA法的診斷靈敏度為66.82%～75%，特異度為98.3%～98.7%。Cai等[24]將ECLIA法與歐洲診斷和歐蒙ELISA試劑盒進行比較，結果發現，ECLIA法與兩種ELISA法的一致性和相關性均較好(Kappa>0.97；rs >0.85)。同時，ECLIA法的精確度及臨床檢測性能相對于2種ELISA法有所提高，且整個檢測過程耗時較ELISA法短，更好地滿足了臨床需求。

3.3 新技術 20世紀90年代初，美國Luminex公司研發出一種高通量的新型生物分子檢測技術，稱為懸浮芯片技術(flexible multi-analyte profiling，xMAP)。該技術集流式技術、熒光微球、數字信號處理和傳統化學技術為一體，將流式檢測與芯片技術較好地結合，使生物芯片反應體系變為完全液相反應體系，也被稱為液相芯片技術。近年來，該技術也被用于抗-CCP抗體檢測[25]。

xMAP技術主要采用聚苯乙烯微珠，其內部標記有2種熒光染料，這2種熒光染料(各有10個濃度梯度)的不同配比產生100種不同編碼的微球，將這些微球表面包被不同的探針，即可同時定量檢測100種不同的抗體。分析時，依次加入目的分子和帶有熒光的報告分子，不同的微球表面探針、目的分子與報告分子間特異性結合，形成了一個懸浮芯片系統。根據流式細胞術原理，將微球排成單列，使其快速通過檢測通道，用2種激光進行檢測。紅色激光激發微球內部的熒光染料，檢測器捕獲信號，將不同微球進行分類，即定性分析；綠色激光激發微球上結合報告分子，確定報告分子的數量即定量分析。該系統只記錄2種熒光同時出現的信號，不記錄未結合的報告分子信號，所以檢測過程中無需洗滌分離。

與ELISA法相比，xMAP的優點有：(1)吸樣量少，一般為5 μL；(2)高通量，可以用一種試劑同時檢測一個樣本中的幾十種不同的分子；(3)高敏感性[26]，xMAP技術的最低檢出限(3.0 μg/mL)是ELISA法(1.5 μg/mL)的2倍；(4)線性范圍寬[26]，xMAP技術的線性范圍(0.06～1.7 μg/mL)比ELISA法(0.006～6.8 μg/mL)寬10倍；(5)重復性好，液相環境有利于保持檢測分子的天然構象和活性，使結果更穩定。

然而，研究[27]發現，40%人類血清中存在能與微珠非特異性結合的抗體，這種抗體類似于免疫測定中的“異嗜性抗體”。微珠與此類抗體結合會引起很強的非特異性的背景，影響檢測結果。Waterboer等[28]發現，用PVX(由聚乙烯醇和聚乙烯基吡咯烷酮組成)或CBS-K試劑對血清進行預處理能大幅度地減少非特異性背景，而對特異性信號僅有微弱影響。

綜上所述，抗原肽提純、合成技術、固相技術以及檢測系統的不斷改進和高通量多元化新技術的引入提高了抗-CCP抗體的檢測水平，縮短了檢測時間，為RA的臨床診斷、療效監測、疾病活動預測等方面提供了更詳細且準確的信息。

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