三種百合科蔥屬植物對五種食源性致病菌抑菌效果的比較

馬春景，趙麗華，楊 帆，李繼源，包 斌，*

(1.上海海洋大學食品學院，上海201306;2.內蒙古農業大學，內蒙古呼和浩特010018;3.內蒙古鄂爾多斯市生態環境職業學院，內蒙古鄂爾多斯014300)

沙蔥(Allium Mongolicum Regel)，學名蒙古韭，屬被子植物門(Angiospermae)，百合科(Liliaceae)，蔥屬(Allium)，為多年生草本旱生植物。分布于我國新疆、青海、甘肅、寧夏、陜西、內蒙古和遼寧［1］。沙蔥具有較高的營養價值［2］，風味獨特，含有2－己烯醛、甲基－2－烯丙基三硫醚［3］等揮發性風味物質，沙蔥地上部分可入蒙藥，主治消化不良、不思飲食和禿瘡、青腿病等［4］。

韭菜(Allium Tuberoum)為百合科蔥屬多年生草本植物，又名起陽草、壯陽草，主要以葉片、假莖供食，是我國特有的蔬菜之一［5］。韭菜含有豐富的纖維素，可以促進腸道蠕動、預防大腸癌的發生，同時又能減少對膽固醇的吸收，從而起到預防和治療動脈硬化、冠心病等疾病的作用［6］;韭菜可治療跌打損傷，有消炎止痛，散瘀止血的功效［7］。此外，韭菜籽具有“溫補肝腎，壯陽固精”功效［8］。

大蒜(Allium Sativum)為百合科蔥屬植物，是一種香辛蔬菜，既有營養價值，又有調味增香和殺菌的作用［9］。大蒜中富含大蒜油，有機硒，超氧化物歧化酶(SOD)，具有抗病毒抗腫瘤及免疫調節作用，并且具有預防心肌梗塞、血管硬化、抗衰老等的功能［10］。

食源性致病菌導致的疾病是食品安全的關鍵問題，其中動物源性食品中金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌O157∶H7、副溶血弧菌、單增李斯特菌等引起的食源性疾病是食品安全的主要問題［11］。目前為止，沒有文獻就這三種百合科蔥屬植物對五種常見食源性致病菌的抑菌作用進行系統的研究和比較，本文通過測定并比較三種百合科蔥屬植物水提取物對這五種菌的抑制作用，以期為進一步探索沙蔥和韭菜在食品安全中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙蔥 采集于內蒙古呼和浩特市人工種植新鮮沙蔥，采集后48h內運到實驗室;新鮮韭菜和大蒜(白皮) 購于當地菜市場;大腸桿菌 O157∶H7(Escherichia coli O157∶H7ATCC43889)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus AB91093)、腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidi CMCC 50041)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus ATCC33847)、單增李斯特菌(Listeria monocytogenes ATCC19115)均由上海海洋大學食品學院微生物實驗室提供;胰蛋白酶大豆瓊脂培養基(TSA)中國檢驗檢疫科學研究院＆北京陸橋技術有限責任公司;胰蛋白胨大豆肉湯培養基(TSB)中國檢驗檢疫科學研究院＆北京陸橋技術有限責任公司。

Elix/Rios純水系統 美國Millipore公司;超聲波清洗機SK－5200HP 上?？茖С晝x器有限公司;實驗室高剪切乳化機上海索維機電設備有限公司;臺式離心機TDL－40B 上海安亭科學儀器廠;微量移液器 法國Gilson公司;恒溫振蕩器DDHZ－300 江蘇太倉實驗設備有限公司;隔水式恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司;SKY－搖床 上海蘇坤實業有限公司;高壓滅菌鍋 MLS－3750 SANYO Labo Autoclave;旋轉蒸發儀 上海申生科技有限公司;超凈臺ACB－4A1(SVE－4A1)上海生叉貿易有限公司。

1.2 提取液(沙蔥、韭菜和大蒜)的制備

將新鮮原料的泥土及干葉去除后用蒸餾水洗凈，用乙醇(75%)沖洗后再用蒸餾水沖洗至無乙醇味，九陽打漿機打漿。取漿液100g，放入500mL燒杯中并加入150mL蒸餾水，實驗室高剪切乳化機進行組織破碎，3500r/min離心20min，上清液于旋轉蒸發儀上濃縮(水浴恒溫45℃，真空)，制成1g/mL(干重)的提取液，裝入離心管中，置于4℃冰箱中保存并當天使用，部分提取液樣品在使用前稀釋成0.25g/mL(干重)。

1.3 抑菌實驗

1.3.1 菌種的活化及菌懸液的制備 將5種菌種分別接入對應的斜面培養基(副溶血性弧含3.5%NaCl)上進行活化，置于37℃恒溫培養箱中培養24h。在無菌條件下，用接種環挑取活化后的菌體，放入10mL對應的液體培養基(副溶血性弧菌含3.5%NaCl)中，37℃搖床培養12h，取出后進行梯度稀釋涂布計數。選出菌數在106cfu/mL的菌液。

1.3.2 濾紙片的制備 用打孔器把定性濾紙打成6mm直徑的圓片，放置于潔凈干燥的培養皿中干熱滅菌。在小濾紙片上滴加提取液，每次滴加10μL，晾干后繼續滴加提取液，滴加方式見表1。

表1 提取物的滴加方式Table 1 The adding methods of extracts

1.3.3 抑菌活性測定 每個平板中加入200μL 106cfu/mL的菌液，倒入20mL左右的已融化并高壓滅菌好的TSA培養基搖勻，待其凝固后將濾紙片等距放入含菌平板(每種菌重復三次實驗)，37℃培養24h后觀察五種菌的生長情況，用卡尺測量每一個抑制圈的直徑(若抑菌圈不規則取最大直徑與最小直徑的平均值)，取平均值。另設蒸餾水作對照。

1.3.4 最低抑菌濃度(MIC)的測定［12］采用2倍稀釋法，以蒸餾水為溶劑，配置一系列梯度濃度為50、25、12.5、6.25、3.13、1.57、0.78g/L 的提取物稀釋液。用移液槍分別吸取1mL稀釋液加入到平板中，與100μL 106cfu/mL的菌液和20mL培養基充分混勻。待培養基冷卻凝固后，置于37℃恒溫培養箱中倒置培養24h，觀察結果，以完全無菌生長的最低濃度為最低抑菌濃度。每個濃度梯度做三個平行，以蒸餾水作對照。

1.3.5 數據分析 每一個處理重復三次(n=3)。采用Excel軟件分析數據并繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 沙蔥水提取液的抑菌效果

圖1是沙蔥水提物對五種食源性致病菌的抑制效果。由圖1可知，沙蔥水提取物加樣量小于5μg時，對大腸桿菌 O157∶H7、腸炎沙門氏菌、副溶血性弧菌及金黃色葡萄球菌沒有抑制作用，對單增李斯特菌有抑制作用，并且隨著加樣量的增加抑菌圈直徑有所增加。當加樣量分別為7.5μg和10μg時，沙蔥水提物對三種菌(腸炎沙門氏菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌)和大腸桿菌O157∶H7開始呈現抑制作用;而對單增李斯特菌而言，提取物加樣量達到10μg時，提取物的抑菌作用消失，其原因有待于更進一步的研究。當沙蔥水提物加樣量大于7.5μg時，對大腸桿菌O157∶H7、腸炎沙門氏菌、副溶血性弧菌及金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑隨著加樣量的增加而增大。當加樣量為50μg時，沙蔥水提物對五種食源性致病菌的抑菌圈直徑為6.0～41.7mm，其對金黃色葡萄球菌的抑菌活性最強(41.7±1.52)mm，大于對大腸桿菌的抑菌活性(28.7±1.52)mm，此結果與李亞蕾［13］對沙蔥提取物的抑菌研究和扈瑞平［14］對沙蔥鮮汁的抑菌研究結果是一致的。

2.2 韭菜水提取液的抑菌效果

圖2是韭菜水提物對5種食源性致病菌的抑制效果。圖2顯示，韭菜水提取物加樣量小于7.5μg時，對大腸桿菌O157∶H7、腸炎沙門氏菌、副溶血性弧菌及金黃色葡萄球菌沒有抑制作用，對單增李斯特菌有抑制作用，并且隨著加樣量的增加抑菌圈直徑逐漸增加;當加樣量達到7.5μg時，韭菜水提物對腸炎沙門氏菌及副溶血性弧菌有抑制作用，并且隨著加樣量的增加而增大;對大腸桿菌O157∶H7和金黃色葡萄球菌沒有抑制作用;對單增李斯特菌有抑制作用達到最大。隨后與沙蔥水提物相似，加樣量為10μg時，對單增李斯特菌的抑菌效應消失，其原因有待于更進一步的研究。當加樣量達到30μg時，韭菜水提物對大腸桿菌O157∶H7、金黃色葡萄球菌開始呈現抑制作用，并在加樣量增加至50μg時，抑菌圈直徑進一步增加。當加樣量為50μg時，韭菜水提物對五種食源性致病菌的抑菌圈直徑為6.0～17.7mm，其中對沙門氏菌的抑菌活性最強(17.7±0.57)mm;同時其對大腸桿菌的抑菌活性(9.3±1.15)mm稍強于對金黃色葡萄球菌的抑菌活性(7.6±0.57)mm，此結果與催亞東等［15］用打孔法對韭菜提取物的抑菌研究結果不同，催亞東等人的研究結果顯示韭菜鮮汁對金黃色葡萄球菌的抑菌效果稍好于對大腸桿菌的抑菌效果，這可能是由于催亞東所用的韭菜鮮汁中抑菌物質與本研究所用的韭菜水提物中抑菌物質不同所致。

圖2 韭菜水提物對5種食源性致病菌的抑制效果Fig.2 Inhibitory effects of Allium Tuberoum extract against test strains

2.3 大蒜水提取液的抑菌效果

圖3是大蒜水提物對5種食源性致病菌的抑制效果。由圖3可知，大蒜水提取物加樣量為2.5μg時，大蒜水提物對這五種食源性致病菌均沒有抑制作用;加樣量增至5μg時，大蒜水提物對大腸桿菌O157∶H7、金黃色葡萄球菌及單增李斯特菌開始呈現輕微的抑制作用，并且隨著加樣量的增加，抑菌圈直徑增大，而對沙門氏菌和副溶血性弧菌沒有抑制作用;加樣量增至7.5μg時，對這五種食源性致病菌均有抑制作用，并且隨著加樣量的增加抑菌活性增大。當加樣量為50μg時，大蒜提取物對五種食源性致病菌的抑菌圈直徑為18.5～29.3mm，其對金黃色葡萄球菌的抑菌活性最強(29.3±2.08)mm。張愛民［16］的研究表明，大蒜汁對傷寒沙門氏菌、痢疾志賀氏菌、及金黃色葡萄球菌有較強的殺滅作用，大腸桿菌的效果次之，與本研究結果一致。

圖3 大蒜水提物對5種食源性致病菌的抑制效果Fig.3 Inhibitory effects of A.sativum L.extract against test strains

2.4 三種水提取液的抑菌效果比較

圖4為提取物添加量為50μg時，三種蔥屬植物的水提物對五種食源性致病菌的抑制效果比較。由圖4可知，對于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和副溶血性弧菌，沙蔥水提物顯示了良好的抑菌活性，其抑菌圈直徑＞大蒜水提物＞韭菜水提物;對于單增李斯特菌，大蒜水提物有抑菌作用，而沙蔥水提物和韭菜水提物對單增李斯特菌沒有抑制作用。許多學者曾對大蒜的抑菌作用進行過研究［17］，并確定大蒜素是大蒜的主要抗菌成分［18］，目前大蒜素作為抑菌劑已廣泛應用于醫學、獸藥、食品添加劑、化妝品等行業［19］。本研究結果顯示:與大蒜水提物相比，沙蔥水取物對四種食源性致病菌有較強的抑菌活性，因此沙蔥有可能被開發成為一種新的天然抑菌劑，應用于食品安全的控制。盡管目前沒有研究探討沙蔥中的抑菌成分，但根據王俊魁等人［3］的研究，沙蔥中含有二烯丙基硫醚，這個成分對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、福氏志賀氏菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌具有一定的抑菌作用［20］，因此這類成分有可能是沙蔥水提物抑菌作用的物質基礎。

圖4 三種水提物對5種食源性致病菌的抑制效果比較Fig.4 Inhibitory effects of three extracts against test strains

2.5 三種蔥屬植物對五種食源性致病菌的最低抑菌濃度

根據五種食源性致病菌在含三種蔥屬植物提取物的培養基中的生長狀況(表2～表4)確定三種提取物對五種致病菌的最低抑菌濃度(MIC)。最低抑菌濃度越低，表明菌對提取物越敏感。大腸桿菌對沙蔥水提物和大蒜水提物的敏感性一致(MIC 6.25g/L)，強于對韭菜水提物的敏感性(MIC 25g/L);金黃色葡萄球菌對大蒜水提物的敏感性最強(MIC 3.13g/L)，對沙蔥水提物的敏感性次之(MIC 12.5g/L)，對韭菜水提物的敏感性最弱(MIC 50g/L);沙門氏菌對大蒜水提物的敏感性最強(MIC 6.25g/L)，對沙蔥水提物的敏感性次之(MIC 12.5g/L)，對韭菜水提物的敏感性最弱(MIC 50g/L);副溶血性弧菌對大蒜水提物的敏感性最強(MIC 6.25g/L)，對沙蔥水提物和韭菜水提物的敏感性一致(MIC 12.5g/L);而單增李斯特菌對這三種蔥屬植物水提物的敏感性相同(MIC 6.25g/L)?？傊?，五種致病菌對大蒜水提物最敏感，其次是沙蔥水提物，而對韭菜水提物的敏感性最弱。

3 結論與討論

三種不同水提取物對這五種食源性致病菌均有一定的抑制作用且具有濃度依賴性，除了單增李斯特菌外，它們對其他四種菌的抑制效果隨著提取物的加樣量的增大而增強;從抑菌圈直徑來看，當提取物添加量為50μg時，抑菌效果強弱順序為沙蔥水提物＞大蒜水提物＞韭菜水提物;從最低抑菌濃度來看，抑菌敏感性強弱順序為大蒜水提物＞沙蔥水提物＞韭菜水提物。綜上結果看出，沙蔥的抑菌活性與大蒜相當，有望作為一種潛在的抑菌劑應用于食品安全領域。

韭菜雖有抗菌能力但遠不能與大蒜和沙蔥的抗菌作用相比。沙蔥、韭菜和大蒜同是百合科蔥屬植物，造成不同水提物間抑菌結果的差異以及同種水提物對不同菌種抑菌結果的差異原因，與其抑菌機理及成分相關，需要通過進一步研究來闡明。

表2 含沙蔥水提物的培養基中五種食源性致病菌的生長情況Table 2 The growth of five food－borne bacterial strains in the culture dishes with AMR

表3 含韭菜水提物的培養基中五種食源性致病菌的生長情況Table 3 The growth of five food－borne bacterial strains in the culture dishes with AT

表4 含大蒜水提物的培養基中五種食源性致病菌的生長情況Table 4 The growth of five food－borne bacterial strains in the culture dishes with AS

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