二甘肽 木糖美拉德反應交聯特性研究

劉 平，邢亞閣，張曉鳴，黃 湛

(1.西華大學生物工程學院，四川成都610039;2.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學食品學院，江蘇無錫214122)

目前，國內外對MRPs中非揮發性化合物的研究，主要是針對氨基酸－還原糖模式體系，研究集中于初級階段的產物或高級階段產物中低分子量的有色組分的分離［1］。而對肽－還原糖體系中MRPs的研究較少，主要研究的是單純二肽或三肽模型體系的反應活性、揮發性化合物和抗氧化性［2－3］，而對肽與氨基酸體系中所形成的非揮發性化合物的研究較少。一方面是由于美拉德反應的復雜性，另一方面由于大部分非揮發性MRPs的極性極強，且很多結構中沒有發色團，很難通過傳統的液相色譜－紫外聯用手段來檢測。雖然采用紫外檢測器檢測MRPs有一定的缺陷，但受目前條件和技術所限，國際上對MRPs中非揮發性成分的研究仍采用此法，許多報道［4－5］仍采用配備紫外檢測器或(和)熒光檢測器的液相色譜進行分離檢測，同時結合LC－MS/MS進行分析。

Ogasawara等［6］通過二次超濾法利用 1000～5000u大豆肽制備的1000～5000u美拉德反應產物(即美拉德肽)具有良好的風味增強效果。但二次超濾成本較高，不適合工業化生產。

本研究以二甘肽－木糖美拉德模式反應體系，通過凝膠色譜及高效液相色譜分離其MRPs，并結合LC－MS及LC－MS/MS技術進行分析，并通過同位素示蹤法驗證糖肽交聯產物的形成，以期為肽－糖美拉德反應產物(尤其是美拉德肽)的有效制備提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

二甘肽(diglycine，分子量132.12)上海億欣生物科技有限公司;D－木糖 中國惠興生化試劑有限公司;［13C5］－木糖 Omicron Biochemicals Inc，美國;葡聚糖凝膠G－10 國藥集團化學試劑有限公司;其他化學試劑均為分析級。

玻璃層析柱(1.6×100cm) 上海廈美生化科技發展有限公司;SunfireTM C18柱(5μm，4.6×150mm) 美國 Waters公司;Ultimate? AQ－C18色譜柱(5μm，4.6×250mm)月旭材料科技(上海)有限公司;XBridge HILIC Hillic色譜柱(5μm，4.6×250mm)美國Waters公司;Atlantis T3柱(5μm，10×150mm)美國Waters公司。

HD－3紫外檢測儀 上海青浦滬西分析儀器廠;恒流泵 上海青浦滬西儀器廠;XWT－S小型臺式記錄儀 上海儀表儀器廠;DBS－100電腦全自動部分收集器 青浦滬西分析儀器廠;TG16－WS臺式高速離心機 湘儀離心機儀器有限公司;F－7000熒光分光光度計日立公司;液相色譜串聯四極桿飛行時間質譜儀(MALDI SYNAPT Q－TOF MS)美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 美拉德反應 將1.0g二甘肽與0.3g木糖溶于9mL去離子水中，混合均勻，用6N NaOH調節pH至7.4，定容至10mL，使混合溶液的最終濃度達到11.5%。每次取1mL混合液于反應瓶中，密封，在120℃下反應30、60、90和120min，反應結束后迅速采用冰水冷卻，反應液于4℃下存放用于分析測定。

1.2.2 熒光強度的測定 根據Morales等［7］的方法稍作修改，將美拉德反應液稀釋50倍，取200μL樣品加入2.3mL pH8.5 0.2moL/L硼酸鹽緩沖液，混勻，在347nm激發波長下進行發射波長掃描，同時以去離子水作空白。

1.2.3 分子量分布的測定 參考Liu等［8］方法。

1.2.4 MRPs的分離純化方法

1.2.4.1 葡聚糖凝膠柱色譜分離 將二甘肽－木糖MRPs混合液在10000r/min離心10min，取出上清液，并配制成 50mg/mL的溶液，取 2mL樣品上Sephadex G－10色譜柱分離，洗脫液為過0.45μm微孔濾膜的去離子水，以30mL/h的流速洗脫，用紫外檢測儀在220nm下檢測，收集峰Ⅰ，減壓濃縮后冷凍干燥。

1.2.4.2 HPLC色譜柱的選擇及分離 將Sephadex G－10收集到的峰Ⅰ組分，選用不同類型的色譜柱進行分離，分離條件如下:

Sunfire色譜柱:進樣體積5μL;流速1mL/min;柱溫35℃;檢測波長，220nm;梯度洗脫條件:0～10min，5～30%B;10～25min，30%～85%B;25～35min，85%～100%B;35～40min，100%B(其中 A:含0.1%TFA的水溶液，B:含0.1%TFA的乙腈溶液)。

Hillic色譜柱:進樣體積5μL;流速1mL/min;柱溫35℃;檢測波長220nm;梯度洗脫條件:0～10min，100～30%B;10～25min，30%～0%B(其中 A:50/50乙腈/10mmoL/L醋酸銨，pH9;B:95/5乙腈/10mmoL/L 醋酸銨，pH9)。

Ultimate? AQ－C18色譜柱:進樣體積5μL;流速1mL/min;柱溫35℃;檢測波長220nm;梯度洗脫條件:0～20min，10～80%B(其中 A:含 0.1%TFA 的水溶液;B:含0.1%TFA的乙腈溶液)。

Atlantis色譜柱:進樣體積5μL;流速1mL/min;柱溫 35℃;檢測波長 220nm;梯度洗脫條件:0～12min，2～16%B;12～20min，16～70%B;20～35min，70～100%B(其中 A:含0.1%TFA 的水溶液;B:含0.1%TFA的乙腈溶液)。

1.2.5 LC－MS及 LC－MS/MS分析 儀器名稱:Waters Synapt MALDI Q－TOF MS(USA)。

液相色譜條件:儀器 Waters ACQUITY UPLC;BEH C－18色譜柱(1.7μm，2.1mm ×100mm);紫外檢測器:檢測波長范圍200～400nm。進樣體積:2μL，流速0.3mL/min。流動相:A:5%乙腈(含0.1%TFA)，B:60%乙腈(含0.1%TFA)。梯度洗脫條件:0～5min，20%～30%B;5～10min，30% ～50%B;10～15min，50%～100%B。

質譜條件:離子源:ESI;離子模式:正離子;毛細管電壓:3.5kV;錐孔電壓:30V;離子源溫度:100℃;脫溶劑氣溫度:400℃;錐孔反吹氣流量:50L/Hr;脫溶劑氣流量:500L/Hr;質量掃描范圍:50～1000m/z;碰撞電壓:6.0～20eV，數據采用MassLynxs 4.0軟件分析。

2 結果與討論

2.1 熒光強度的變化

美拉德反應過程中熒光性物質的形成符合零級動力學反應。MRPs具有典型的熒光波譜特征，激發波長為 340～370nm 和發射波長為 420～440nm［9－10］。通過熒光強度的變化，可分析MRPs中新物質的生成情況。二甘肽－木糖體系在不同反應時間下的MRPs在激發波長347nm下的熒光強度如圖1所示。

圖1 二甘肽－木糖MRPs的熒光強度隨反應時間的變化Fig.1 Changes in fluorescence intensity of MRPs from diglycine－xylose systems as a function of time

由圖1可知，美拉德反應開始前，體系中只有糖和肽時，肽在發射波長347nm處時有最大熒光強度。隨著加熱時間的延長，產物中肽的最大熒光強度值逐漸減小，同時有一新的峰生成，其在430nm處有最大熒光強度。隨著反應時間的延長，產物熒光強度逐漸增強，這個現象與Morales等［7］的研究結果類似。通常熒光強度是衡量蛋白質糖苷化產物和熒光性反應產物生成量的指示劑。本研究的結果發現，肽糖的交聯物也有此熒光性特征。由此說明，在美拉德反應中，肽的結構發生了變化，產物中有新的物質生成，這些新的物質包括糖肽的交聯產物等。Baisier等［11］猜測熒光性化合物的積累來源于氨基化合物的Strecker降解或中間產物中活性還原性化合物的進一步反應形成的。熒光性物質和有色化合物的關系目前還不完全清楚，熒光性化合物通常被認為是有色物質形成的前體物。

2.2 分子量分布分析

為了進一步評價小肽與木糖在美拉德反應中的交聯作用，采用凝膠液相色譜對二甘肽－木糖各體系在120℃下反應120min的產物的分子量分布進行了分析，結果如圖2所示。

圖2 二甘肽－木糖MRPs的分子量分布圖Fig.2 Distribution of molecular weight of MRPs derived from diglycine－xylose system

由圖2可知，在二甘肽－木糖體系中，相對分子質量700～5000的產物相對百分含量占1.86%，500～700產物占3.16%，180～500產物之間的占46.27%。由此可知，小肽與還原糖在高溫下反應可形成較高分子量的 MRPs。Kim 等［12］研究發現，在100℃ 下加熱甘氨酸/二甘肽/三甘肽－葡萄糖體系，各體系中大分子物質的比例隨著加熱時間的延長也顯著增加。Clark等［13］研究發現蛋白質骨架與糖通過聚合形成含高分子量的化合物。

2.3 二甘肽－木糖體系MRPs的分離分析

2.3.1 葡聚糖凝膠柱色譜的分離 葡聚糖凝膠是根據分子量差異進行分離的一種技術，是蛋白質和肽等化合物分離中常用的分離手段，近年來的研究將其用于MRPs中不同分子量組分的分離［14］。由于二甘肽—木糖MRPs中分子量幾乎都是相對分子質量小于700的組分，因此選用葡聚糖凝膠G－10對此體系120min的產物進行初步分離，結果如圖3所示。從圖3可知，經葡聚糖凝膠G－10分離后，可得到三個組分，組分Ⅰ和組分Ⅱ是有色物質，組分Ⅲ是無色物質。其中，組分Ⅰ中分子量分布較大的產物的比例相對較高，因此收集該組分并進行進一步的分離。

圖3 凝膠過濾色譜G－10分離二甘肽－木糖MRPs在220nm下的圖譜Fig.3 UV－vis spectrum at 220nm of MRPs derived from diglycine－xylose system purified by Sephadex G－10

2.3.2 液相色譜柱的篩選 根據MRPs具有較強的極性特性，選用 Sunfire、Hillic、Ultimate和 Atlantis T3色譜柱對葡聚糖凝膠G－10中收集到的組分Ⅰ進行分離，經分離條件初步優化后，在各柱較好的分離條件下的分離結果如圖4所示。

由圖4可知，經Sunfire、Hillic和Ultimate色譜柱分離后，出現的峰較少，分離效果較差，表明該三種色譜柱不適合二肽－木糖高溫MRPs的分離。相比之下，采用Atlantis T3色譜柱分離后，分離效果較好，色譜圖中出現的峰較多，表明該柱子較適合該類產物的分離。因此，選用 Atlantis T3色譜柱對二甘肽－木糖的MRPs進行分離。

2.3.3 Atlantis T3色譜柱對二甘肽－木糖MRPs的分離 對葡聚糖凝膠G－10中分離得到的組分Ⅰ采用Atlantis T3色譜柱進行分離，經分離條件優化后，得到的最佳條件下的分離結果如圖5所示。

如圖5所示，圖譜中出現六個峰，各峰經液質檢測發現，各峰中仍含有多種化合物，峰Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅵ中檢測到的主要是質荷比較小的物質，而峰Ⅴ中的既有質荷比較小的物質也有較大的物質，因此集中收集峰Ⅴ，并采用液相色譜對其進一步分離。

2.3.4 二次液相色譜的分離 對第一次液相色譜分離收集到的峰Ⅴ組分，仍采用液相色譜進行二次分離，經液相色譜柱的進一步篩選后，發現Atlantis T3色譜柱分離效果較好，因此仍采用此柱繼續分離，結果如圖6所示。

由圖6發現，經第二次液相色譜分離，圖譜中出現8個峰，表明待分離組分在Atlantis T3色譜柱上被較好的分離，將收集到的8個組分進一步采用LC－MS技術進行分析。

2.3.5 LC－MS分析 通過選擇合適的電噴霧電壓、碰撞能量等質譜分析條件，并在正、負離子兩種掃描方式下分別對二次HPLC技術分離得到的8個組分進行一級全掃描質譜分析，得到分子離子峰，該美拉德在正離子下信號相應值較高。結果發現各峰的一級質譜中仍含有多個離子峰，其中峰Ⅱ中有離子峰較大的組分，其它組分中的離子峰均較小，因此著重對峰Ⅱ進行研究，其紫外圖譜和總離子流圖譜如圖7所示。

圖4 不同液相色譜柱的分離效果圖Fig.4 HPLC spectrums from different columns

由圖7所示，紫外圖上顯示有兩個主要的峰，在4min以前化合物基本上從色譜柱上洗脫下來。與紫外圖譜上的兩個峰上的保留時間對應，在總離子流圖上在4min以前也基本有兩個峰。經分析發現，第一個峰中各化合物的分子離子峰基本上均不超過m/z 379，第二個峰中各化合物的分子離子峰m/z較小，主要是低于300的離子峰。在二甘肽－木糖美拉德反應體系中，盡管分子量分布測出MRPs中相對分子質量超過500以上的產物比例超過5%，而通過質譜并未檢測出這段分子量所對應物質的質荷比，這種現象可能是由于該體系中高分子量的MRPs在質譜上的信號較弱所致［15－16］。

2.3.6 LC－MS/MS分析 為了進一步分析糖肽交聯產物的結構，采用二甘肽－［13C5］－木糖體系作對照反應。在對照體系所形成的MRPs中，相同保留時間下LC－MS圖譜中未觀察到分子離子峰為m/z 379，而檢測出一新的分子離子峰m/z 389，推測m/z 389和m/z 379所對應的MRPs實為同位素標記和未標記的結構相同的化合物。對分子離子峰m/z 379和m/z 389采用LC－MS/MS技術進行分析，所得的二級質譜結果如圖8所示。

圖5 二甘肽－木糖MRPs經Atlantis T3色譜柱分離的液相色譜圖Fig.5 HPLC spectrum of MRPs derived from diglycine－xylosel system purified by Atlantis T3 column

圖6 二甘肽－木糖體系MRPs經Atlantis T3色譜柱二次分離的液相色譜圖Fig.6 The second HPLC spectrum of MRPs derived from diglycine－xylose system purified by Atlantis T3 column

圖7 峰Ⅱ的紫外圖譜(a)和總離子流圖(b)Fig.7 UV and total ion currency(TIC)profiles of peakⅡ by LC－MS

圖8 分子離子峰m/z 379和m/z 389的二級質譜圖Fig.8 LC－MS/MS profile of molecular ion peak m/z=379 and m/z 389

由圖8a中的二級質譜數據可知，在二甘肽－木糖體系所形成的MRPs中，m/z 379為分子離子峰，m/z 361、343、221和133是其裂解產生的碎片離子峰。由分子離子峰m/z 379及其碎片離子峰可推測，分子離子峰m/z 379經連續2次脫水分別形成碎片離子峰m/z 361和m/z 343，后者進一步斷裂成碎片離子峰m/z 211和m/z 133。

由圖8b可知，在二甘肽－［13C5］－木糖對照體系所形成的MRPs中，m/z 389為分子離子峰，其裂解產生的碎片離子峰有 m/z 371、353、221和133。由此可知，分子離子峰m/z 379和m/z 389有相同的特征片段m/z 133，其余對應的碎片離子峰在m/z上相差10，進一步驗證m/z 379和m/z 389可能為結構相同的物質，m/z的差異主要是由于后者反應底物為同位素標記的［13C5］－木糖產生的。由此可初步推測，分子離子峰m/z 379所對應的化合物所含有的碳原子中有10個來源于木糖或木糖的降解產物，除碎片m/z 133外其余的碎片均為含糖碎片。

3 結論

肽與還原糖經高溫美拉德反應后，產物變得極為復雜，分離困難，直接獲得糖肽單一的MRPs難度較大，通過同位素示蹤法初步推斷美拉德反應產物的形成及結構是一種較好的選擇。除了形成揮發性風味物質外，小肽在高溫下與還原糖或其降解產物可形成較大分子量的交聯產物。由此推測，可通過一定分子量的肽開發具有風味增強特性的美拉德肽(1000～5000u MRPs)。

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