P38信號轉導通路在胃泌素促進人大腸癌細胞SW480增殖中的作用及其機制

茆家定,陶 亮,吳 佩

(皖南醫學院附屬弋磯山醫院 胃腸二科，安徽 蕪湖 241001)

胃泌素是一種由胃竇和十二指腸黏膜G細胞分泌的一種肽類激素，對消化道黏膜有營養作用。近來研究發現胃泌素可抑制細胞凋亡并且促進大腸癌細胞的增殖[1-2]，我們通過觀察胃泌素對體外培養的人大腸癌細胞株SW480增殖和凋亡的影響，以及P38蛋白表達情況及其磷酸化水平分析，初步探討P38-絲裂素活化蛋白激酶(motogen-actived protein kinase，MAPK)信號傳導通路在胃泌素促進大腸癌細胞增殖中的作用及其調控機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人大腸癌細胞株SW480購自中國科學院上海生命科學研究院；RPMI-1640培養基和胎牛血清購自美國Hyclone公司；胰蛋白酶購自碧云天公司；5-肽胃泌素購自Biosharp公司；丙谷胺購自中國藥品生物檢定所；噻唑蘭(MTT)購自Biosharp公司；細胞周期染色試劑盒購自凱基公司；PVDF膜、牛血清蛋白、羊抗小鼠多克隆抗體、兔抗人多克隆抗體購自Biosharp公司；ECL化學發光試劑購自Millipore公司；β-肌動蛋白抗體購自碧云天公司；P38及磷酸化P38兔抗人多克隆抗體購自美國Cell Signaling technology公司；Trizol 試劑購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒購自加拿大Fermentas公司；螢光染料購自Biosharp公司；胃泌素受體/膽囊收縮素-B受體(cholecystokinin-B receptor,CCK-BR)mRNA擴增引物由上海生工生物公司合成。

1.2 細胞培養和分組 將SW480細胞復蘇后培養，當長滿瓶壁的80%以上后進行細胞傳代。取對數生長期細胞消化離心，去除消化液和培養液后加入凍存液，進行細胞凍存，最終將其放入-70℃液氮箱中備用。本實驗將細胞分為胃泌素組(PG)、丙谷胺組(PGL)、胃泌素+丙谷胺組(PG+PGL)和對照組。

1.3 qRT-PCR檢測細胞內CCK-BR表達 按照Trizol試劑一步法提取細胞總RNA，之后再按逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA,再以等量的cDNA為模板進行qRT-PCR反應，反應條件如下：預變性95 ℃，30 s，之后每一步變性95 ℃，15 s，退火延伸53.9 ℃，30 s，共進行39個循環；PCR結束后制作溶解曲線，95 ℃變性30 s，然后冷卻至65 ℃，從65 ℃開始到95 ℃，每一步增加0.5 ℃，保持10 s。胃泌素/膽囊收縮素受體(CCK-2R)mRNA引物序列：上游5′-TCTCGCGAGCTCTACTTAGGG-3′,下游 5′-ACCGACGATGCACGTTGAAG-3′;β-肌動蛋白 mRNA引物序列：上游 5′-TGACGTGGACATCGCAAG-3′,下游 5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′。其擴增產物分別為185 bp、203 bp。

1.5 流式細胞儀檢測細胞增殖 取對數生長期細胞用胰蛋白酶消化后，以1 000 r/min離心5 min后棄去上清液，通過10%胎牛血清培養液調整細胞濃度為1.7×105個/ ml 的細胞懸液,接種于6孔培養板中(2 ml/孔),培養24 h后更換為無血清培養液,繼續培養24 h,吸去上清液,每孔加入含處理因素1%胎牛血清培養液2 ml。設胃泌素組(12.50 g/L)、丙谷胺組(16.00 mg/L)、胃泌素(12.50 mg/L)+ 丙谷胺(16.00 mg/L)組和對照組,每組各設5個復孔,培養48 h。結束培養時,用不含EDTA的胰蛋白酶消化后,置離心機內以15 000 r/min離心10 min，棄上清；加入1 ml冷的PBS輕輕震蕩使細胞懸浮，12 000 r/min離心10 min，棄上清。重復用冷的PBS洗兩次,棄去上清液后，緩慢滴入1 ml 70%冷乙醇固定，4 ℃保存過夜。第2日進行DNA、蛋白質染色,上機進行流式細胞儀測定,計算細胞周期中各期比例及增殖指數。

1.6 Western blot檢測P38蛋白及磷酸化P38表達水平 取定量的細胞總蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，并轉移至PVDF膜上，室溫下封閉2 h后，用TBST漂洗2次，加入一抗(P38和磷酸化P38用5%牛血清蛋白稀釋至1∶2 000)4 ℃搖床孵育過夜，用TBST洗3次后，加辣根過氧化物酶標記的二抗(用TBST稀釋至1∶5000)，溫室搖床孵育2 h，用TBST洗3次，ECL化學發光試劑盒自顯影后，放入全自動化學發光圖像系統內成像。并用Image J軟件對圖像進行條帶平均光密度值分析，結果以目標基因蛋白表達分別與β-肌動蛋白表達的比值表示。

2 結果

2.1 SW480細胞中CCK-BR mRNA表達 CCK-BR mRNA熒光實時定量PCR擴增產物為185 bp，qRT-PCR采用2-ΔCt的方法進行分析。既往通過RT-PCR的方法已經驗證HT-29中有CCK-2R的表達將SW480細胞(1.58±0.17)與HT-29細胞(1.70±0.13)進行比較,t=0.99,P>0.05，無統計學意義。SW480細胞存在著CCK-BR mRNA的表達。

2.2 各組SW480細胞增生活力檢測結果 MTT檢測結果顯示:胃泌素濃度在6.25～200.00 mg/L范圍內對SW480細胞有促生長作用，當胃泌素濃度增加到12.50 mg/L 時OD值最大，促增生能力最強(P<0.05)，繼續增加胃泌素濃度OD值并不隨其濃度增加而繼續升高；而胃泌素受體拮抗劑丙谷胺濃度為8.00～256.00 mg/L濃度時，對SW480細胞增生活力影響差異無統計學意義(P>0.05)，但胃泌素濃度為最佳濃度12.50 mg/L時，丙谷胺在一定范圍內能明顯拮抗胃泌素促進SW480細胞的增殖作用,其濃度在16.00 mg/L以上時，胃泌素+丙谷胺組活細胞數趨于一恒定值，丙谷胺最佳的拮抗濃度為16.00 mg/L(P<0.01)。見表1。

表1 各組SW480細胞增生活力檢測結果

注:a與對照組比較，P<0.05

2.3 各組細胞增殖指數檢測結果 胃泌素(12.50 mg/L)組細胞增殖指數為(34.56±1.41)%，顯著高于對照組的(28.74±1.61) %和胃泌素(12.50 mg/L)+丙谷胺(16.00 mg/L)組的(28.72±1.78)%(P<0.05)，而丙谷胺(16.00 mg/L)組細胞增殖指數為(27.75±2.29)%，與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組細胞增殖指數

注：a與其余三組比較，P<0.05

2.4 各組細胞中P38及其磷酸化水平 藥物作用SW480細胞48 h后，對照組、胃泌素(12.50 mg/L)組、丙谷胺(16.00 mg/L)組和胃泌素(12.50 mg/L)+丙谷胺(16.00 mg/L)組間P38的蛋白水平進行比較，差異有統計學意義(P<0.01)。胃泌素組(12.50 mg/L)低于對照組(P<0.01)，也低于胃泌素(12.50 mg/L)+丙谷胺(16.00 mg/L)組(P<0.05)。四組間磷酸化P38蛋白水平比較有統計學意義，差異顯著(P<0.01)。胃泌素組(12.50 mg/L)低于對照組(P<0.05)，也低于胃泌素(12.50 mg/L)+丙谷胺(16.00 mg/L)組(P<0.05)；丙谷胺(16 mg/L)磷酸化P38蛋白水平與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

3 討論

胃泌素的異常表達可導致大腸癌細胞的生長失控形成腫瘤,其作用能夠被胃泌素受體拮抗劑丙谷胺抑制[3]。本研究結果顯示胃泌素在一定的濃度梯度范圍內可促進大腸癌SW480抑制凋亡、促進增殖，當濃度達到12.5 mg/L時繼續增加胃泌素濃度，抑制作用不再繼續增強，這一現象符合受體的飽和學說。通過流式細胞儀檢測細胞周期發現，胃泌素能夠通過加速細胞周期S、G2期的進程，促進SW480細胞增殖,這種促增殖的作用能夠被其受體拮抗劑丙谷胺抑制。研究結果還發現，丙谷胺單用對大腸癌細胞增殖無明顯影響，當胃泌素與丙谷胺聯合應用時，較單用胃泌素組細胞增殖指數明顯下降，與對照組比較差異無統計學意義。而且丙谷胺在一定濃度范圍內可拮抗胃泌素的促增殖作用，其最佳濃度為16.00 mg/L，繼續增加濃度，拮抗作用不再增加，反而呈現減弱的現象。丙谷胺拮抗胃泌素的促增殖,從另一個角度證明了受體的飽和學說。

表3 各組細胞中P38蛋白表達及磷酸化水平的比較

注：a與對照組比較,P<0.01；b與胃泌素組比較，P<0.01

胃泌素能夠與其受體結合發揮生物學效應，促進大腸癌細胞增殖，但它是通過何種信號傳導通路來實現對大腸癌細胞生長的調控仍不十分清楚。絲裂原活化蛋白激酶家族(MAPKs)參與細胞凋亡的信號轉導過程，MAPKs包括ERK1/2、JNK、P38等主要組分，在多數細胞中，P38和JNK抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡，ERK促進細胞增殖，但在有些細胞中情況相反[4]。茆家定等人發現胃泌素可促進HT-29增殖，同時胃泌素ERK1/2蛋白的磷酸化水平明顯高于對照組[5]。為了進一步探討其具體分子機制,我們從P38信號傳導途徑著手了解胃泌素與此信號通路的關系。P38是真核細胞介導細胞外信號到細胞內反應的重要信號傳導蛋白激酶，是MAPK家族的一員，包括4種亞基，P38α、P38β、P38γ、P38δ。P38α是第一種被人類發現的P38 MAPK，其可被多種刺激因素激活，其中包括生長因子、血管內皮生長因子等。P38上游的MAPKK可通過磷酸化P38的Thr-Gly-Tyr位點中的酪氨酸使P38活化，再進一步調控下游基因的表達，調控細胞的增殖與凋亡[6]。所以，可以通過磷酸化來了解信號通路活化與否以及活化的強弱。下調P38使其發揮調節作用，抑制Bcl-2的表達，啟動Bax等P38下游基因的表達促進凋亡[7]。本研究結果顯示胃泌素能顯著下調P38磷酸化水平，丙谷胺單獨作用對P38蛋白在SW480細胞中的磷酸化水平無明顯影響，但在丙谷胺與胃泌素聯合作用時，丙谷胺能顯著拮抗胃泌素使磷酸化-P38蛋白在SW480細胞中表達下調的作用，然而對各組間的P38蛋白表達水平進行比較，發現差異無統計學意義?？梢酝瞥鑫该谒貙τ诖竽c癌細胞株SW480的促增殖、抑制凋亡作用，可能是通過下調磷酸化P38水平，降低P38的活化來實現的，但此信號傳導通路能夠被胃泌素受體拮抗劑丙谷胺阻斷。

總之，胃泌素能夠促進體外大腸癌SW480細胞增殖、抑制凋亡，并受胃泌素受體表達水平的限制，同時能夠被其受體拮抗劑丙谷胺抑制。P38信號轉導通路參與了胃泌素對大腸癌細胞增殖與凋亡的調控，其具體機制可能是通過調控信號轉導通路下游哪種靶具體的基因來實現，仍需進一步的研究。此外，如果我們能夠通過競爭性抑制胃泌素受體或有效地干擾P38信號通路,促進癌細胞凋亡，有望為胃泌素依賴型大腸癌綜合治療尋找到一條新的切入途徑。

【參考文獻】

[1] ELLRICHMANN M,RITTER PR,SCHRADER H,etal.Gastrin stimulates the VEGF-A promotor in a human colon cancer cell line[J].Regul Pept,2010,165(2-3):146-150.

[2] KOVAC S,ANDERSON GJ,BALDWIN GS.Gastrins,iron homeostasis and colorectal cancer[J].Biochim Biophys Acta,2011,1813(5):889-895.

[3] KOVAC S,XIAO L,SHULKES A,etal.Gastrin increases its own synthesis in gastrointestinal cancer cells via the CCK2 receptor[J].FEBS Lett,2010,584(21):4413-4418.

[4] MOHAPATRA P,PREET R,CHOUDHURI M,etal.5-fluorouracil increaces the chemopreventive potentials of resveratrol through DNA damage and MAPK signaling pathway in human colorectal cancer cells[J].Oncol Res,2011,19:311-321.

[5] 茆家定,錢海鑫,吳佩，等.ERK-MAPK信號轉導通路在胃泌素促進人大腸癌細胞增殖中的作用及其機制[J].中華消化外科雜志,2013,12(2),139-144.

[6] MONDAL S,MANDAL C,SANGWAN R,etal.Withanolide D induces apoptosis in leukemia by targeting the activation of neutral sphingomyelinase-ceramide cascade mediated by synergistic activation of c-Jun N-terminal kinase and p38 mitogen-activated protein kinase[J].Mol Cancer,2010,13;9:239.

[7] 茆家定，錢海鑫，吳佩,等.神經酰胺信號轉導通路在胃泌素抑制大腸癌細胞凋亡中的作用及其機制研究[J].中華實驗外科學雜志,2013,30(10):2104-2107.