缺鋅脅迫對水稻葉綠體抗氧化系統的影響*

陳文榮， 陳雅彬， 陳 莉， 張常晶， 黃志恒， 孫培蓓

(浙江師范大學 化學與生命科學學院,浙江 金華 321004)

鋅是生物體不可缺少的微量元素之一[1]，在核酸合成、基因表達、細胞生長等過程中起著至關重要的作用.植物中缺鋅會阻礙植株的生長發育，導致產量和品種質量下降.水稻(OryzasativaL.)作為重要的栽培糧食作物，對鋅元素極為敏感，一旦缺鋅，會引起水稻葉片失綠發白、根系老化、分蘗減少、植株矮小、生長停滯等現象，從而嚴重影響水稻的產量和口感[2].

缺鋅會直接或間接地影響SOD及AsA-GSH循環中相關酶的活性，從而限制對活性氧的清除.缺鋅條件下，不同物種的植物均表現出活性氧簇(ROS)的積聚及氧化脅迫的加劇，但抗氧化系統在不同物種間的表現不盡相同.水稻受缺鋅脅迫后，葉內ROS含量上升、膜脂過氧化加劇,葉綠體超微結構受損明顯，同時光合速率及熒光參數均顯示缺鋅對水稻光系統破壞嚴重[3],但這種損傷是否與ROS的氧化脅迫相關仍缺乏直接的實驗證據.另外，作為產生ROS的主要細胞器，水稻葉綠體中ROS的濃度、抗氧化系統的抗氧化能力在缺鋅脅迫下的動態變化亦需要進一步深入研究.

本文以水稻品種日本晴(Nipponbare)為材料，利用水培法進行不同程度的缺鋅處理，研究了水稻葉綠體中活性氧代謝水平、膜脂過氧化程度及抗氧化物質(AsA和GSH)含量、SOD和AsA-GSH循環中相關酶(APX，GR等)活性在缺鋅脅迫中的動態變化，以期揭示缺鋅脅迫下水稻葉綠體中抗氧化系統在防御氧化損傷中的響應機制.

1 材料與方法

1.1 實驗設計

1.1.1 植物培養

實驗材料為水稻品種日本晴.種子經75%乙醇溶液消毒后，浸種2 d，37 ℃下催芽，挑選出芽較好且一致的種子移栽在96孔板上，放入溫室內(光照14 h/黑暗10 h，白天28 ℃ /夜晚24 ℃，相對濕度75%，光照強度2 000 lx)用蒸餾水培養，2周后水稻用營養液培養[13]，營養液pH 5.5.

1.1.2 缺鋅處理

待水稻長至三葉期進行缺鋅處理.設計3個鋅處理組，即足鋅、潛在缺鋅及嚴重缺鋅，其鋅濃度分別設置為1.0×10-6,1.0×10-10和0 mol/L.鋅處理時間為20 d.

1.2 實驗方法

1.2.1 葉綠體的制備

待水稻處理完后，取地上部，通過差速離心法制備粗葉綠體制品，分別利用蔗糖密度梯度離心法和Percoll梯度離心法進一步分離純化完整的葉綠體.緩沖溶液(0.05 mol/L磷酸鹽，5 mmol/L乙二胺四乙酸，pH 7.8)懸浮葉綠體，用于測定抗壞血酸(AsA)和谷胱甘肽(GSH)的含量，以及超氧化物歧化酶(SOD，EC 1.15.1.1)、抗壞血酸過氧化物酶(APX，EC 1.11.1.11)、谷胱甘肽還原酶(GR，EC 1.6.4.2)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR，EC 1.8.5.1)和單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR，EC 1.6.5.4)的活性.

1.2.2 水稻根和葉中鋅含量的測定

水稻處理好后，取根和葉，于65 ℃烘干研磨后，取0.1 g加8 mL硝酸和1 mL高氯酸，常溫靜置過夜，然后消解.樣品消解后用超純水定容至50 mL，過濾后用電感耦合等離子質譜儀ICP-MS(Agilent，7500a)測定Zn元素的含量[14].

1.2.4 丙二醛(MDA)含量的測定

用硫代巴比妥酸(TBA)比色法測定MDA含量.50 mg葉綠體樣品用80%乙醇溶液溶解，超聲波裂解，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，沉淀重新提取2次.稀釋一定倍數，加入等體積的100 g/L三氯乙酸(TCA)溶液，4 000 r/min離心10 min，上清液為樣品提取液[15].取提取液2 mL(空白加入等量的重蒸餾水)，加入2 mL 5 g/L TBA溶液混勻，沸水浴20 min，迅速冷卻離心10 min，測定A532 nm和A600 nm的值.

1.2.5 AsA和GSH含量的測定

取葉綠體懸浮液1 mL，加入1.5 mL重蒸餾水，2.5 mL 50 g/L TCA溶液，混勻，4 000 r/min離心，上清液用于測定AsA和GSH的含量.

取0.1 mL上清液，加0.7 mL 75 mmol/L NaH2PO4溶液(pH 7.4)，再加0.2 mL 100 g/L TCA溶液，0.2 mL 440 g/L H3PO4溶液，0.2 mL 40 g/L 2,2-二聯吡啶溶液和0.1 mL 30 g/L FeCl3溶液，37 ℃反應1 h，測定A525 nm的值，根據AsA的標準曲線，計算AsA的含量[16].

取0.1 mL上清液，加1.3 mL 150 mmol/L NaH2PO4溶液(pH 7.2)和0.1 mL 5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)，30 ℃保溫5 min，測定A412 nm的值.根據GSH的標準曲線，計算GSH的含量[17].

1.2.6 SOD活性的測定

SOD活性采用氮藍四唑(NBT)光還原法測定.取0.05 mL酶液，加3 mL反應液(1.3 μmol/L 核黃素,13 mmol/L甲硫銨酸,63 μmol/L NBT,100 μmol/L EDTA和0.5 mol/L pH 7.8磷酸鹽)混勻后，于光強4 000 lx下反應15 min，測A560 nm的值，以緩沖液代替酶液作空白，以抑制氮藍四唑光化還原的50%為1個酶活單位[18].

1.2.7 APX活性的測定

APX活性的測定參照文獻[19]的方法，取3 mL反應液(0.5 mmol/L AsA，0.1 mmol/L EDTA，0.1 mmol/L H2O2，0.05 mol/L pH 7.0磷酸鹽)和0.1 mL酶液，將30%H2O2溶液稀釋500倍，加15 μL至3 mL反應體系中啟動反應，測定A290 nm的值，記錄1 min內的變化.抗壞血酸的消光系數為2.8 mmol/(L-15cm-1)，以1 min氧化1 μmol抗壞血酸的酶量為1個酶活單位.

1.2.8 GR活性的測定

依照文獻[20]的方法并適當修改，即反應體系中依次加2.46 mL 1 mmol/L氧化型谷胱甘肽(GSSG)溶液，0.24 mL 2 mmol/L還原型輔酶Ⅱ(NADPH.溶于磷酸緩沖液，pH 7.6)和0.3 mL酶提取液，以重蒸餾水代替GSSG溶液作空白對照，測定A340 nm的值，記錄3 min內的變化.NADPH的消光系數為6.2 mmol/(L-15cm-1)，以1 min催化還原1 nmol谷胱甘肽的酶量為1個酶活單位.

1.2.9 DHAR活性的測定

采用紫外分光光度法測定DHAR的活性.在反應體系中依次加入2.1 mL 50 mmol/L EDTA溶液，0.3 mL 2 mmol/L脫氫抗壞血酸(DHA)溶液,0.3 mL 2 mmol/L GSH溶液和0.3 mL酶提取液，測定A265 nm的值，記錄3 min內的變化(消光系數為14 mmol/(L-15cm-1))[21].

1.2.10 MDHAR活性的測定

采用紫外分光光度法測定MDHAR活性.反應體系中依次加入2.49 mL 2 mmol/L AsA溶液(磷酸緩沖液，pH 7.0),0.06 mL 2 mmol/L APX溶液(磷酸緩沖液，pH 5.6),0.15 mL 2 mmol/L NDAPH溶液(磷酸緩沖液，pH 7.6)和0.3 mL酶提取液，測定A340 nm的值，記錄3 min內的變化(消光系數為6.2 mmol/(L-15cm-1))[21].

1.3 數據分析

每一處理進行3次生物性重復和3次實驗性重復.數據統計和顯著性分析分別用Excel和SPSS 17.0軟件，用SigmaPlot 10.0軟件作圖.

2 結果與分析

2.1 缺鋅脅迫下水稻不同部位的鋅含量

為檢測水稻根部和葉部鋅營養的實際狀態，分析了不同缺鋅處理下根和葉中的鋅含量.如圖1所示，隨缺鋅處理的加重，水稻根部及葉部的鋅含量顯著降低.根部，潛在缺鋅處理和嚴重缺鋅處理后的鋅含量分別只有對照的19/50和7/25.葉部，各處理下鋅含量分別是40.8，15.6和10.6 mg/kg.另外，在不同缺鋅處理下，根部的鋅含量均比葉內高，但兩者的變化趨勢是一致的.

不同小寫字母表示根和葉各處理間在P<0.05水平上差異顯著圖1 不同缺鋅條件下水稻根和葉鋅含量的變化

2.2 缺鋅脅迫下水稻葉綠體內H2O2和的相對含量

對照的含量設為100%.不同的英文小寫字母表示各處理間在P<0.05水平上差異顯著圖2 缺鋅對水稻葉綠體內過氧化氫和超氧陰離子自由基相對含量的影響

2.3 缺鋅脅迫下水稻葉綠體內的MDA含量

丙二醛(MDA)是植物器官膜脂過氧化最重要的產物之一，其含量高低能說明膜脂過氧化程度的大小[22].如圖3所示：相較于對照，潛在缺鋅條件下，水稻葉綠體內MDA含量雖有所上升，但未呈現出顯著性差異；在嚴重缺鋅處理下，水稻葉綠體中MDA含量達3.64 nmol/mg，較對照增加了76.70%.

2.4 缺鋅脅迫下水稻葉綠體內AsA和GSH的含量

抗壞血酸(AsA)幾乎存在于所有的組織中，一般是在需氧的光合細胞和果實中含量較高，是一種非酶類的自由基清除劑.如圖4所示，隨著缺鋅程度的增加，AsA含量先升高再降低，其中潛在缺鋅條件下葉綠體AsA含量較對照升高了19.9%，而嚴重缺鋅下葉綠體內AsA含量較對照

圖3 缺鋅對水稻葉綠體內MDA含量的影響

降低了21.0%.但脫氫抗壞血酸(DHA)與AsA的變化趨勢相反.潛在缺鋅處理下DHA含量顯著降低，較對照降低了34.5%；而嚴重缺鋅處理下DHA含量與對照無顯著性差異.

葉綠體中谷胱甘肽(GSH)含量隨缺鋅程度的增加而不斷下降.對照植株GSH含量分別比潛在缺鋅和嚴重缺鋅處理的多0.29倍和1倍.氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量在對照、潛在缺鋅和嚴重缺鋅條件下分別是0.34，0.35和0.49 μmol/mg.

AsA/DHA和GSH/GSSG是植物細胞中相互關聯的重要的氧化還原對，它們的含量比能反映細胞內氧化還原的狀態[23].本研究中，AsA/DHA的含量比隨著缺鋅程度的增加而先增加后降低，但GSH/GSSG的含量比隨著缺鋅程度的增加不斷降低.

圖4 缺鋅對水稻葉綠體內抗壞血酸和谷胱甘肽含量的影響

2.5 缺鋅脅迫下水稻葉綠體內SOD的活性

從圖5可見，潛在缺鋅處理下葉綠體內SOD活性較對照有所上升，而嚴重缺鋅下該酶活性急劇下降.對照、潛在缺鋅和嚴重缺鋅處理下葉綠體內SOD活性分別為152.44,181.89和76.13 U/mg.相較于對照，潛在缺鋅處理下葉綠體內SOD活性上升了19.32%，嚴重缺鋅處理的下降了50.06%.

圖5 缺鋅對水稻葉綠體內SOD活性的影響

2.6 缺鋅脅迫下水稻葉綠體內APX的活性

在AsA-GSH循環系統中， 抗壞血酸過氧化物酶(APX)以AsA為電子供體催化H2O2的還原.圖6顯示的是在缺鋅脅迫下水稻葉綠體內APX活性的變化，該酶活性的變化趨勢與SOD相似，在潛在缺鋅處理下APX活性最高，達374.09 U/mg，而嚴重缺鋅處理的較對照的APX活性下降了40.27%.

圖6 缺鋅對水稻葉綠體內APX活性的影響

2.7 缺鋅脅迫下水稻葉綠體內GR的活性

谷胱甘肽還原酶(GR)是一種黃素蛋白氧化還原酶[24]，當植物受氧化脅迫時，活性氧能將GSH氧化成GSSG，GSSG又能在GR的催化下利用NADPH的電子將GSSG還原為GSH.如圖7所示：潛在缺鋅處理下葉綠體內GR活性最高，達到110.67 U/mg，是對照的2倍多；而嚴重缺鋅處理下葉綠體內GR活性與對照相比無顯著性差異.

圖7 缺鋅對水稻葉綠體內GR活性的影響

2.8 缺鋅脅迫下水稻葉綠體內MDHAR的活性

單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)是AsA-GSH循環中再生AsA的重要酶.隨著缺鋅程度的增加，MDHAR的活性先升高后顯著下降.對照的MDHAR活性是163.64 U/mg，潛在缺鋅處理的比其活性升高了40.18%，而嚴重缺鋅處理的MDHAR活性下降了83.71%(見圖8).

圖8 缺鋅對水稻葉綠體內MDHAR活性的影響

3 討 論

鋅在水稻的生長發育中至關重要，可增加植物體內的葉綠素含量，催化葉綠素的光合作用，間接影響生長素的合成，在維持細胞膜的完整性等方面起作用.目前普遍認為，缺鋅對植物造成損傷的根本原因在于鋅缺乏使植物體內的活性氧自由基過量積累，進而破壞植物細胞的關鍵結構和重要成分[9].在正常生長條件下，植物體內活性氧濃度不高，并能及時被植物自身的抗氧化系統清除，從而使活性氧的產生和清除一直處于動態平衡狀態，避免了植物的損傷[25].但是，一旦活性氧的量超過了植物正常所能承受的閾值后，就會打破細胞內氧化還原狀態的平衡，從而引發氧化脅迫傷害.

葉綠體是植物進行光合作用的場所，是產生活性氧的主要細胞器.缺鋅能引起光合反應電子傳遞過程中超氧自由基的產生[26]，過量積累的活性氧自由基將對葉綠體類囊體膜造成嚴重傷害[27]，進而破壞葉綠體的結構和功能.本研究中活性氧在潛在缺鋅處理下產生的量最多，說明植物受到了一定的氧化脅迫；嚴重缺鋅處理下可能是過度的膜脂氧化對植物細胞造成了不可逆的損傷和破壞，甚至使細胞死亡，因此活性氧含量低于對照.同樣，MDA檢測中發現，在嚴重缺鋅處理中其含量最高，說明水稻葉綠體膜脂過氧化程度高，損傷程度大.

AsA-GSH循環系統是植物體內清除活性氧自由基的重要途徑，該循環實質上由2個小循環構成，即AsA與MDHA之間的循環和GSH與GSSG之間的循環.其中，AsA和GSH是AsA-GSH循環中2種重要的非酶促抗氧化物質，它們能直接與活性氧反應使其還原，或作為相應酶的底物在活性氧清除過程中扮演重要的角色，通常兩者相互偶聯起作用(見圖9).AsA被氧化時會形成

圖9 潛在缺鋅脅迫下水稻葉綠體AsA-GSH循環模式圖

MDHA，MDHA很不穩定，又會進一步氧化形成DHA，DHA在DHAR作用下又可以再生成AsA.GSH因其結構上存在巰基，使其成為細胞內強有力的還原劑，而氧化態的GSSG在GR的作用下能夠形成還原態的GSH.本研究中，在潛在缺鋅條件下，AsA含量顯著上升，而DHA含量呈相反的趨勢，這可能是水稻應對缺鋅脅迫引發的ROS積聚的一種應對反應(見圖4(a)和(b))；而GSH含量隨著缺鋅程度的加重呈現遞減趨勢，可能是由于細胞內大量的GSH用于各種活性氧的解毒過程，從而導致GSSG的含量遞增(見圖4(c)和(d)).另外，AsA/DHA和GSH/GSSG的含量比能反映細胞內氧化還原的狀態，與植物響應逆境脅迫緊密相關，植物體內較高的AsA/DHA和GSH/GSSG的含量比有利于提高AsA-GSH循環的效率，減輕不良條件造成的氧化脅迫[32].本研究中，AsA/DHA含量比呈現先上升后下降的趨勢(見圖4(e))，說明在潛在缺鋅處理時，葉綠體內通過加快AsA的合成，使抗壞血酸庫中還原型抗壞血酸占優勢，從而增強抗逆性.這與桑樹[33]中受缺鋅影響得到的結果類似：AsA隨鋅濃度的降低先增加后下降，AsA/DHA含量比也是潛在缺鋅狀態下達最高值.另外，本研究中發現,潛在缺鋅和嚴重缺鋅處理下GSH/GSSG含量比都小于對照(見圖4(f))，表明GSH和GSSG小循環隨著缺鋅程度的增加運作效率降低.但水稻在缺鎂脅迫下GSH含量和GSH/GSSG含量比均出現顯著上升的變化[34].可見，AsA-GSH循環的變化復雜，不同物種對不同脅迫的應對機制不同.

作為葉綠體中能有效分解H2O2的重要酶之一，APX先與H2O2形成中間復合物，接著以AsA為底物氧化形成MDHA和H2O.本實驗中，1.0×10-10mol/L鋅處理的水稻葉綠體中APX活性高于對照，而且高活性的APX與高含量的AsA的作用是一致的.說明潛在缺鋅處理使葉綠體中的AsA含量足以維持APX的活性，甚至可能與高濃度的活性氧共同刺激APX活性升高.APX活性的適應性升高同樣出現在缺鋅處理下的紅球甘藍[35]中.但APX對環境的脅迫非常敏感，嚴重缺鋅處理導致APX活性急劇下降(見圖6).MDHA可以在MDHAR作用下重新生成AsA.MDHAR的活性隨著缺鋅程度的增加呈現先升高后下降的趨勢(見圖8).嚴重缺鋅處理下葉綠體內MDHAR活性較對照下降了83.71%，該酶活性急劇下降導致將MDHA還原成AsA的反應速率下降，使得MDHA氧化成DHA的反應增加，這與AsA/DHA含量比變化的結果相符(見圖4(e)).但本研究中未能在水稻葉綠體中檢測到DHAR的活性，可能是葉綠體中GSH循環與AsA循環偶聯作用小，靠GSH協同DHAR還原DHA生成AsA成分少.

在植物體內，GR能使谷胱甘肽庫保持在還原狀態，AsA-GSH循環中GSSG通過GR還原.本研究中，GR活性與APX活性的變化相似，嚴重缺鋅處理下葉綠體內GR活性與對照相當，而潛在缺鋅處理下葉綠體內GR活性是對照的2倍多.GR活性高使得GSSG的還原速度加快，有利于抵御ROS的毒害.Frei等[31]對水稻受土壤缺鋅影響時的抗氧化系統進行了研究，發現3種基因型的水稻(RIL46，IR74和RIL76)GR活性都極顯著上升，表明GR作為GSH循環中的關鍵酶，在水稻應對缺鋅脅迫中發揮著重要作用.

綜上所述，本研究結果表明，在潛在缺鋅脅迫下，水稻葉綠體內的活性氧含量升高，使得SOD,APX,GR和MDHAR的活性增加，說明植株通過增加抗氧化酶的活性來緩解外界環境產生的刺激及建立自我保護機制；另外，植株通過調節AsA-GSH循環中抗氧化物質的水平來適應逆境環境.但是，隨著缺鋅程度的加深，抑制了很多酶的活性，降低了植株的自我保護能力，加劇了膜脂過氧化的程度，甚至導致細胞死亡.

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