RP-HPLC法測定毛果魚藤中美迪紫檀素的含量

吳紅果，黃 威，婁華勇，梁光義，潘衛東

(1. 貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室，貴州 貴陽 550002; 2. 遵義醫學院 藥學院，貴州 遵義 563099; 3. 貴州大學 生命科學學院，貴州 貴陽 550025)

毛果魚藤 (DerriseriocarpaHow)為豆科(Leguminosae)魚藤屬(Derris)植物。主要分布在云南、廣西一帶，別名為土甘草、雞血藤、藤甘草等[1]。其根入藥能夠補血、潤腸，常用于治療咳嗽、發燒胸悶、咽喉痛；藤莖具有鎮咳化痰、利尿除濕的功效，民間常用來治療膀胱炎、腎炎、尿道炎、咳嗽等癥[2-4]。目前毛果魚藤中已報道的化學成分有三萜、甾體、脂肪酸類化合物[5-6]，其他類型的化學成分尚未見報道。本課題組對毛果魚藤藥材的化學成分進行了系統研究，從中分離鑒定了三萜、甾體和一系列黃酮類成分，其中黃酮類化合物美迪紫檀素為其主要的化學成分，據相關文獻報道，美迪紫檀素具有抗結核、抗真菌及抗腫瘤等作用[7-9]。到目前為止，毛果魚藤中黃酮類化合物的含量測定方法尚未見報道。為了更有效的控制毛果魚藤的質量，本文首次以美迪紫檀素作為指標性成分，采用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)，建立了毛果魚藤藥材中美迪紫檀素的RP-HPLC含量測定方法，以期對毛果魚藤的研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent-1100高效液相色譜系統(G1311A泵、G1315A DVD檢測器、Agilent色譜工作站)，SG5200H超聲波清洗儀(河南兄弟儀器設備有限公司)，梅特勒-托利多AL204電子天平(上海速展計量儀器有限公司)；色譜純乙腈和甲醇為天津登科化學試劑有限公司產品，水為重蒸水并經0.45 μm水系濾膜過濾，其他試劑均為分析純。

1.2 試藥 美迪紫檀素對照品為自制，經ESI-MS、UV、IR、1H-NMR和13C-NMR鑒定為美迪紫檀素，經DVD檢測器檢測，峰面積歸一化法計算其純度>98%；毛果魚藤藥材采自貴州省興義市，經貴陽市中醫學院陳德媛教授鑒定為豆科魚藤屬植物毛果魚藤DerriseriocarpaHow，樣本保存在貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品儲備液 精密稱取美迪紫檀素對照品2.86 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm有機系濾膜過濾，取續濾液，即得對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液 取樣品粉末(過40目篩)約5.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇150 mL，密塞，稱定質量，室溫下冷浸30 min，超聲處理120 min，取出，冷卻至室溫，再稱定質量，用甲醇補足至原質量，搖勻，0.45 μm有機系濾膜過濾，取續濾液，即得供試品溶液。

2.2 色譜條件與系統適應性 采用Hypersil-BDS C18色譜柱 (5 μm,250 mm×4.6 mm)，柱溫為30.0 ℃，流動相為乙腈 (A)-0.1 %醋酸水溶液(B)梯度洗脫(0～30 min,20% A→40% A, 80% B→60% B)，流速為1.0 mL/min，檢測波長為276 nm，進樣體積為20 μL。在以上色譜條件下，美迪紫檀素對照品和毛果魚藤樣品色譜圖(見圖1)。

圖1 毛果魚藤樣品(A)與美迪紫檀素對照品(B)的HPLC色譜圖

2.3 線性關系考察 分別吸取“2.1.1”項下美迪紫檀素對照品儲備液適量。分別以1、2、4、8、10、16、20 μL的進樣體積注入液相色譜儀，按“2.2”色譜條件測定，以對照品進樣量 (ng) 為橫坐標 (X)，峰面積積分值為縱坐標 (Y)，經線性回歸處理得美迪紫檀素的回歸方程：Y=2.064X+5.7612，R2= 0.9992。結果表明，美迪紫檀素在0.0572～1.1440 μg范圍內有良好的線性關系。

2.4 精密度試驗 精密吸取美迪紫檀素對照品儲備液，連續進樣6次，按“2.2”色譜條件測定，記錄美迪紫檀素的峰面積，RSD (n = 6) 為1.70 %。說明精密度良好。

2.5 穩定性試驗 按照“2.1.2”的方法配制供試液1份，在“2.2”色譜條件下，每隔4 h進樣1次，每次20 μL共6次，記錄美迪紫檀素的峰面積，RSD為1.55 %，數據表明供試液在24 h內基本穩定。

2.6 重復性試驗 取毛果魚藤藥材1批，按“2.1.2”項下方法操作，制得6份供試液，分別進樣20 μL，記錄美迪紫檀素的峰面積，并計算含量。平均含量為0.002 8%，RSD為1.27%。說明該方法的重復性良好。

2.7 加樣回收試驗 精密稱取已知含量的樣品2.5 g共6份，另精密稱取美迪紫檀素對照品0.085 mg。依照“2.1.2”的方法制備供試液，平行制備6份，按“2.2”色譜條件測定，記錄美迪紫檀素的峰面積，計算樣品含量和回收率。結果表明美迪紫檀素平均回收率為100.78 %，RSD為1.81 %(見表1)。

表1美迪紫檀素加樣回收率試驗

序列取樣量/g樣品中含量/mg加入量/mg測得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%12.50400.07010.0850.153798.3522.50350.07010.0850.154599.2932.50570.07020.0850.1582103.5342.50320.07010.0850.1564101.5352.50270.07010.0850.1563101.4162.50460.07010.0850.1556100.59100.781.81

2.8 樣品含量測定 依照“2.1.2”的方法制備3個批次的供試液，每個批次平行制備3份供試液。按“2.2”色譜條件測定樣品含量，記錄美迪紫檀素的峰面積，含量測定結果(見表2)。

表2美迪紫檀素含量的測定

批次取樣量/g峰面積含量/10-3 %平均含量/10-3 %RSD/%5.0050228.9702.7015.0011221.7682.622.671.565.0080227.1422.685.0016224.5972.6525.0048231.5992.732.701.715.0056231.4392.735.0028229.8092.7135.0037223.3552.632.651.865.0014222.2222.62

3 討論

3.1 提取溶劑的選擇 取供試品粉末約2 g，分別用甲醇、乙醇、乙酸乙酯為溶劑超聲30 min，乙酸乙酯液蒸干后用甲醇溶解，并按上述色譜條件進行測定，結果表明以甲醇為提取溶劑時雜質峰較少。

3.2 提取方法的選擇 以甲醇為溶劑，取供試品粉末約2 g，精密稱定分別用超聲提取和加熱回流提取2種方法提取，并按上述色譜條件進行測定，結果表明用超聲提取其提取率較高。

3.3 流動相的選擇 分別以甲醇-水，甲醇-0.1 %醋酸水溶液，乙腈-水，乙腈-0.1 %醋酸水溶液為流動相，更換流動相比例，采用等度洗脫，均不理想。采用梯度洗脫，并乙腈-0.1 %醋酸水溶液為流動相，發現美迪紫檀素與其他成分分離效果較好。

3.4 檢查波長的選擇 美迪紫檀素對照品溶液的3D高效液相圖譜顯示，其在200 nm和276 nm處有最大吸收，但200 nm處于紫外末端吸收，易導致圖譜基線漂移，故選擇276 nm作為檢測波長。

本研究首次建立了以美迪紫檀素為指標成分的毛果魚藤藥材的RP-HPLC含量測定方法，該方法簡便、準確，重復性好，可用于毛果魚藤藥材的質量控制。

[參考文獻]

[1] 中國植物志編委會.中國植物志[M].北京:科學出版社,1994：194-195.

[2] 陳少鋒,余勝民,黃琳蕓,等.土甘草止咳祛痰作用研究[J].時珍國醫國藥,2009,20(11):2691-2692.

[3] 郭力城,楊東愛,余勝民,等.土甘草藥理作用研究[J].時珍國醫國藥,2010,21(1):154-155.

[4] 楊立芳,于偉,楊東愛,等.毛果魚藤藤莖的性狀與顯微鑒別[J].中藥材,2006,29(11):1162-1164.

[5] 張憲民,李忠榮,邱明華,等.魚藤的三個新三萜化合物[J].云南植物研究,2002,24(6):787-791.

[6] 吳紅果,婁華勇,梁光義,等.毛果魚藤化學成分研究[J].中成藥,2014,36(4):785-788.

[7] Canman Martínez-Sotres,Pablo López-Albarrn,José Cruz-de, et al. Medicarpin, an antifungal compound identified in hexane extract of Dalbergia congestiflora Pittier heartwood [J]. International Biodeterioration & Biodegradation, 2012, 69: 38-40.

[8] Rayanil K O, Bunchornmaspan P, Tuntiwachwuttikul P. A new phenolic compound with anticancer activity from the wood ofMillettialeucantha[J]. Arch Pharm Res, 2011, 34(6): 881-886.

[9] Oh I, Yang W Y, Chung S C, et al. In vitro sortase a inhibitory and antimicrobial activity of flavonoids isolated from the roots of Sophora flavescens [J]. Arch pharm Res,2011,34(2):217-222.