DNA-PKcs影響肝癌耐藥細胞BEL7402/5-FU耐藥性的機制

李長福，梁大敏，束 波，楊加偉，生 欣，范 芳

(遵義醫學院 生物化學教研室，貴州 遵義 563099)

在細胞的生存過程中DNA會遭受各種內外源性因素的損傷，使DNA發生單鏈或雙鏈斷裂(double-stranded breaks, DSBs)，如果這些損傷得不到及時修復，可引起細胞基因組不穩定性增加，最終導致細胞死亡，這也是抗癌藥物致腫瘤細胞死亡的主要機制[1-2]。非同源重組修復(nonhomologous end-joining，NHEJ)是哺乳動物細胞中最重要的一種修復機制， DNA依賴性蛋白激酶催化亞基(DNA-dependent kinase catalytic subunit，DNA-PKcs)是NHEJ的核心組分，在DSBs修復及癌癥預防方面發揮重要作用[3-4]。

為進一步研究DNA-PKcs在NHEJ修復通路及腫瘤細胞DNA損傷修復中的作用，本研究將靶向DNA-PKcs的干擾質粒shDNA-PKcs轉染肝癌耐藥細胞BEL7402/5-FU，觀察DNA-PKcs基因沉默對其下游分子Artemis的激活作用，探討DNA-PKcs基因影響肝癌細胞Bel7402/5-FU 耐藥性的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 PRNAi-U6.1-Neo shRNA質粒(百奧邁科生物科技有限公司)，BEL7402/5-FU細胞株(南京凱基公司)， LipofectamineTM2000 Reagent(Invitrogen公司)，DNA-PKcs抗體(Assay biotech公司)，Artemis抗體及P-Artemis抗體(abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 用含10%FBS、20 μg/mL 5-FU的1640培養液培養BEL7402/5-FU細胞，置于37 ℃、5%CO2孵箱中培養，細胞貼壁生長，隔天傳代。

1.2.2 細胞轉染 將培養好的BEL7402/5-FU細胞分為4組：空白對照組、脂質體組、空質粒組和shDNA-PKcs轉染組。細胞計數后，將BEL7402/5-FU細胞按8×104細胞/孔接種于6孔培養板中，當細胞生長到70%～80%融合時進行轉染，按200 μL/孔將質粒-脂質體復合物加至相應培養孔中，6 h后換液。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測DNA-PKcs mRNA水平的表達 按Trizol?Reagent試劑盒說明書提取各組細胞總RNA行real-time PCR擴增，DNA-PKcs及β-actin引物見參考文獻[5]。實驗組和對照組DNA-PKcs mRNA表達量通過公式2-( △△CT)分析計算。

1.2.4 Western blot檢測DNA-PKcs、Artemis及P-Artemis蛋白表達 按常規方法提取各組細胞總蛋白，BCA法計算樣品蛋白濃度。取50 μg蛋白樣品與上樣緩沖液混勻，SDS-PAGE電泳后轉移到NC膜上，室溫封閉1h，加一抗4℃過夜，用TBST洗膜3次。加二抗37℃孵育1h后TBST洗膜3次，用ECL發光液顯色曝光，Quantity One定量分析軟件分析灰度比。

2 結果

2.1 DNA-PKcs mRNA水平表達 實時熒光定量PCR檢測結果顯示(見圖1)：各對照組細胞中DNA-PKcs mRNA表達無明顯差異(P>0.05)，shDNA-PKcs轉染組DNA-PKcs mRNA的表達較對照組明顯下調(P<0.01)。

**:與空白對照組相比圖1 各組細胞DNA-PKcs mRNA相對表達量

2.2 DNA-PKcs、Artemis及P-Artemis蛋白的表達 轉染shDNA-PKcs 48h后收集細胞，通過Western blot檢測各組細胞DNA-PKcs、Artemis及P-Artemis蛋白的表達。Western blot檢測結果顯示(見圖2～4)：各對照組細胞中DNA-PKcs、Artemis及P-Artemis蛋白的表達無明顯變化(P>0.05)；shDNA-PKcs轉染組DNA-PKcs、Artemis蛋白表達均下降，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)；shDNA-PKcs轉染組P-Artemis蛋白表達與對照組比較無差異 (P>0.05)。

A：空白對照組;B：脂質體組;C：質粒對照組;D：shDNA-PKcs轉染組。圖2 各組細胞DNA-PKcs、Artemis和P-Artemis蛋白表達情況

**:與空白對照組相比 P<0.05。圖3 各組細胞DNA-PKcs蛋白的表達

**:空白對照組相比 P<0.05。圖4 各組細胞Artemis和P-Artemis蛋白表達情況

3 討論

目前認為，腫瘤的發生與細胞DNA損傷及其修復機制缺陷有關，而腫瘤細胞對放化療的敏感性主要取決于細胞DNA損傷修復的能力。NHEJ是哺乳動物細胞中最重要的一種修復機制，DNA-PKcs是NHEJ的核心組分，在DSBs修復及癌癥預防方面發揮重要作用[3-4]。在NHEJ中，Artemis是DNA-PKcs的下游靶分子，在DNA損傷修復、細胞周期檢測及腫瘤耐藥中均起關鍵作用。

DNA -PKcs是由4128個氨基酸組成的相對分子量為469kD的大分子量蛋白質，當細胞發生DSBs時，DNA-PKcs招募NHEJ中的組分Ku70/80迅速結合到DNA斷端，通過自身磷酸化和磷酸化下游蛋白如Artemis、DNA ligase4、XRCC4等對損傷DNA進行修復[6-7]。DNA-PKcs被認為具有腫瘤抑制功能，能維持基因組穩定性。目前已有一些研究表明下調DNA-PKcs能增加腫瘤細胞對藥物的敏感性[8-9]。在NHEJ中，Artemis是DNA-PKcs的下游靶分子，具有多個DNA-PKcs的磷酸化位點[10-12]。本課題組前期研究工作發現：轉染靶向DNA-PKcs的干擾質粒后，肝癌耐藥細胞BEL7402/5-FU對化療藥物的敏感性增加[5]，而DNA-PKcs是NHEJ修復通路中的核心組分，說明腫瘤細胞中DNA損傷修復與腫瘤耐藥有關。為進一步了解DNA損傷修復與肝癌細胞耐藥的機制，觀察肝癌耐藥細胞在DNA損傷修復過程中DNA-PKcs基因對其下游靶分子的激活情況，探討NHEJ修復通路肝癌耐藥中所起的作用，本實驗用Western blot法檢測了轉染shDNA-PKcs后各組細胞Artemis、P-Artemis蛋白表達情況，結果顯示DNA-PKcs沉默后肝癌耐藥細胞BEL7402/5-FU中DNA-PKcs及Artemis蛋白表達減少，說明DNA-PKcs表達的抑制可以下調其下游靶分子Artemis的表達；而轉染組P-Artemis表達與對照組相比無差異，說明DNA-PKcs的沉默不能抑制Artemis的磷酸化，因此推測Artemis不僅是DNA-PKcs的下游靶分子，還有可能是其他信號通路的靶分子。事實上，有研究表明Artemis參與NHEJ修復過程中還需要ATM的激活[13-14]。因此DNA-PKcs沉默所致Bel7402/5-Fu細胞耐藥性降低，不一定與DNA-PKcs/Artemis通路有關，可能還有其他信號通路共同參與，其作用機制還需要進一步研究。

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