阿奇霉素對斑馬魚心臟毒性的初步研究

崔國禎，周鶴峰，陳煥嫻，李銘源

(1.遵義醫學院珠海校區 生物工程系，廣東 珠海 519041;2.澳門大學 中華醫藥研究院中藥質量研究國家重點實驗室，澳門 999078)

阿奇霉素是第1個氮雜內酯類抗生素，是一較新的廣譜大環內酯類抗生素。1980年，南斯拉夫藥廠普利瓦(Pliva)成功研發阿奇霉素，并于1981年獲批上市。美國輝瑞公司(Pfizer)得到全球開發權后，將其推向全球市場，使用廣泛。阿奇霉素抗菌譜廣，抗菌活性較好，并具有良好的藥代動力學特性(半衰期較長，每天僅需服藥1次)，是目前我國臨床抗細菌感染的主流藥物之一。阿奇霉素在早期的使用過程中，一般認為其相對心臟毒副作用小[1]。然而, 近10年來，越來越多的臨床數據提示，阿奇霉素有潛在的心臟毒副作用的風險。早期的個案臨床心臟毒性報道主要表現為心臟QT間期延長而發生心律失常，尤其是可發生尖端扭轉型室性心動過速的危險[2]，但未引起醫藥界的廣泛關注。直到2012年，《新英格蘭醫學雜志》刊發的一項美國臨床研究表明，服用阿奇霉素顯著增加了患者心血管死亡和心臟性猝死的風險[1]，該報道為阿奇霉素的安全使用敲響了警鐘。鑒于阿奇霉素存在心血管事件的安全隱患，本文主要評價阿奇霉素對斑馬魚心臟形態和功能的影響，為抗菌類藥物心臟毒性的作用機理研究及臨床安全用藥提供依據。

1 材料與方法

1.1 藥物與動物 阿奇霉素粉末購自石家莊歐意藥業有限公司，野生型和心臟轉基因斑馬魚由澳門大學中華醫藥研究院中藥質量研究國家重點實驗室繁殖。

1.2 方法

1.2.1 斑馬魚胚胎形態和心率的觀察及評價 挑選發育良好的2 d大的斑馬魚胚胎于12孔板，每孔12條，藥物處理分別為：正常對照組和給藥組(0.03、0.1、0.3和1 mm)。為了抑制斑馬魚的黑色素而清楚的觀察斑馬魚的心臟形態及其功能，將斑馬魚在含有1-苯基-2-硫脲(PTU)的培養液里給藥處理3 d后，將斑馬魚放置于室溫，適應環境溫度15 min以上。在體式顯微鏡觀察下觀察并記錄斑馬魚的心率。將不同處理組的斑馬魚置于玻璃片上，用1%的低熔點瓊脂固定使之固定其呈側臥狀態(兩側眼、體節重合，尾部與身體處于同一水平面)或正臥狀態(腹部向下方，身體左右對稱)，用活細胞工作站系統CELLR(Olympus，日本)連續拍照片(200張/14 s的速度)。

1.2.2 斑馬魚心搏量的計算 按照文獻報道的方法[3 - 4]，采用心搏量(stroke volume)進一步評價斑馬魚心臟的功能。從視屏文件找到心室的舒張期和收縮期圖片(見圖1),測量心室的長軸(用a表示)和短軸(用b表示)，用橢球形的體積公式計算心室的體積：V=4/3π(a/2)(b/2)2；心搏量的計算：Stroke volume=V舒張期-V收縮期。

圖1 斑馬魚幼魚心室長軸和短軸長度的測量方法

2 結果

2.1 阿奇霉素對斑馬魚胚胎心臟形態及其心率的影響 為了評價阿奇霉素對斑馬魚胚胎心臟功能的影響，我們首先對斑馬魚胚胎心臟形態和心率參數做了觀察。心搏量反應心室每收縮1次射出的血液量，是評價心臟功能的一個重要指標。0.3 mm阿奇霉素對2 d大的斑馬魚胚胎處理3 d后，心包囊水腫形成(見圖2B)，心臟體積變大，心膜出血。由圖2C的統計結果可知，與正常對照組相比，0.3 mm和1 mm阿奇霉素造模組的心率明顯下降(P< 0.05)。

A:對照組；B:0.3 mm阿奇霉素處理3 d后的斑馬魚心臟部位形態，箭頭表示心臟部位；C:不同濃度的阿奇霉素對斑馬魚心率的影響；與對照組比較，#P <0.05。圖2 阿奇霉素對斑馬魚心臟形態和心率的影響

2.2 阿奇霉素對斑馬魚幼魚心搏量的影響 為了進一步評價阿奇霉素對斑馬魚胚胎心臟功能的影響，我們對其心搏量做了計算統計。0.3 mm和0.1 mm阿奇霉素對2 d大的斑馬魚胚胎處理3 d后，心臟的心搏量減少(見圖3AB和CD)。由圖3E的統計結果可知，與對照組相比，0.3 mm和0.1 mm阿奇霉素處理組的心搏量明顯下降(P<0.05)。

A:對照組心室舒張期，箭頭表示斑馬魚的心室; C:對照組心室收縮期；B:0.3 mm阿奇霉素組斑馬魚心室舒張期;D:0.3 mm阿奇霉素組斑馬魚心室收縮期；E:阿奇霉素對斑馬魚胚胎心搏量的影響；與對照組比較，#P <0.05。圖3 阿奇霉素對斑馬魚胚胎心臟功能的影響

3 討論

斑馬魚在發育早期，身體是透明的，在顯微鏡下可以直觀快速的觀察評價心臟的功能，是研究心臟功能的理想體內模型。斑馬魚的胚胎在受精2 d后，心臟發育基本成形[5]。0.3 mm和0.1 mm阿奇霉素作用受精2 d的斑馬魚胚胎3 d后，可見其心臟腫大、心膜出血、心率下降、心搏量減少等。本實驗首次發現阿奇霉素對斑馬魚胚胎心臟有一定的毒性作用，與最近臨床阿奇霉素心臟毒性的報道的結果相符，故可以用來研究阿奇霉素等抗菌藥物引起的心臟毒性。

心血管疾病嚴重危害我國人口健康，近幾年因心血管疾病死亡占總死亡原因的41%[6],某些嚴重心臟毒性已經成為人類死亡的原因之一。由于心臟毒性導致開發藥物失敗和從市場上撤回的事件也屢屢發生。比如抗菌藥物格帕沙星(Grepafloxacin)于1993年在美國上市，于1999年由于心臟的毒副作用從市場撤出[7]，2007年的羅格列酮心血管安全性爭議[8]。確保藥物無心臟毒副作用，是藥物開發的重要問題，越來越受到國內外相關研究部門的重視。近日，國外報道大環內酯類抗生素類阿奇霉素會引起心血管的毒性作用。由阿奇霉素引起的心血管等毒性所導致的死亡風險比阿莫西林高出很多。其中每21 000服用阿奇霉素的病人就有1人由于心血管的毒副作用引起死亡，其引起死亡的風險遠遠高于同等條件下的阿莫西林[9]。2013年5月在《新英格蘭醫學雜志》再次發表了關于阿奇霉素誘發心臟毒性的文章。我們回顧分析了從1997年到2010年使用阿奇霉素和未使用該類藥物患者心臟性猝死事件。其中2組是服用和未服用阿奇霉素的樣本量均為1 102 050例。另外2組分別為阿奇霉素和青霉素V給藥，樣本量分別為1 102 419和7 364 292。結果發現，與未使用阿奇霉素的病例相比，使用5 d療程阿奇霉素相關的心血管死亡事件明顯升高，發生率約1.1‰。與青霉素相比，心血管事件的發生沒有明顯增加[10]。其次，我國對此現象也做了簡單的報告[11 - 12]。

阿奇霉素引起QT間期延長、誘發心動過速等心臟毒性的具體機制不清楚。大環內酯類抗生素包括紅霉素(靜脈滴注或口服)、克拉霉素、阿奇霉素、羅紅霉素、螺旋霉素的心臟毒性的作用機制有一定的報道。實驗證實，紅霉素可使豚鼠心肌細胞動作電位顯著延長，通過抑制鈉鉀離子通道，并特異性地抑制了跨膜鉀電流[13 - 14]，這可能是紅霉素在臨床應用誘發心臟毒性的機制，特別是心律失常的機制。阿奇霉素心臟毒性的機制，可能也與心肌細胞動作電位和鉀離子電流的調控有關系。雖然阿奇霉素抗菌作用廣泛、抗菌活性強，但其心臟的毒副作用，會嚴重影響其在臨床上使用。目前，還未見采用心臟保護藥物以減輕抗菌藥物引起的心臟毒性的報道。因此，闡明阿奇霉素心臟毒性的作用機理，尋找針對該藥有效的心臟保護藥物和對阿奇霉素化學結構的進一步改進修飾以達到減輕心臟毒性是一種可行的研究方向，值得醫藥工作者去思考研究。其次，由阿奇霉素誘導的斑馬魚胚胎心臟毒性模型成功的建立，為抗菌類藥物心臟毒性的作用機理研究奠定了基礎。

[參考文獻]

[1] Ray W A, Murray K T, Hall K, et al. Azithromycin and the risk of cardiovascular death [J]. N Engl J Med, 2012, 366(20): 1881-1890.

[2] Kim M H, Berkowitz C, Trohman R G. Polymorphic ventricular tachycardia with a normal QT interval following azithromycin [J]. Pacing Clin Electrophysiol,2005,28(11):1221-1222.

[3] Zhang Y, Wang C, Huang L, et al. Low-level pyrene exposure causes cardiac toxicity in zebrafish (Danio rerio) embryos [J]. Aquat Toxicol, 2012,15(3):114-115.

[4] Chen Z Y, Huang W, Dahme T, et al. Depletion of zebrafish essential and regulatory myosin light chains reduces cardiac function through distinct mechanisms [J]. Cardiovascular Research, 2008, 79(1): 97-108.

[5] Bakkers J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease [J]. Cardiovascular Research, 2011, 91(2): 279-288.

[6] 王文, 朱曼璐, 王擁軍, 等. 心血管病已成為我國重要的公共衛生問題——《中國心血管病報告2011》概要 [J]. 中國循環雜志, 2012, 06): 409-411.

[7] Kang J, Wang L, Chen X L, et al. Interactions of a series of fluoroquinolone antibacterial drugs with the human cardiac K+channel HERG [J]. Mol Pharmacol, 2001, 59(1): 122-126.

[8] Nissen S E, Wolski K. Effect of rosiglitazone on the risk of myocardial infarction and death from cardiovascular causes [J]. N Engl J Med, 2007, 356(24): 2457-2471.

[9] Mosholder A D, Mathew J, Alexander J J, et al. Cardiovascular risks with azithromycin and other antibacterial drugs [J]. N Engl J Med, 2013, 368(18):1665-1668.

[10] Svanstrom H, Pasternak B, Hviid A. Use of azithromycin and death from cardiovascular causes [J]. N Engl J Med, 2013, 368(18): 1704-1712.

[11] 金璐燕, 邢愛敏. 阿奇霉素存在誘發心血管事件而致死的風險 [J]. 藥學進展, 2012,36(6): 288.

[12] 梁義瓊. 阿奇霉素可能增加心源性猝死風險 [J]. 心血管病防治知識：科普版,2012,7:56.

[13] 王海昌, 賈國良. 紅霉素對豚鼠單心室肌細胞APD及主要跨膜離子電流的作用 [J]. 第四軍醫大學學報, 2001,22(21):1927-1929.

[14] 王俊杰, 朱寶亮, 朱蘇紅,等. 紅霉素的心臟電生理效應 [J]. 醫學綜述, 2009,09(15): 1407-1409.