響應面優化酶法澄清琯溪蜜柚汁工藝研究

許 鍵，蔡慧農,2,3，倪 輝,2,3，杜希萍,2,3，黃高凌,2,3

(1.集美大學生物工程學院，福建 廈門 361021； 2.福建省高校食品微生物與酶工程技術研究中心，福建 廈門 361021；3.廈門市食品與生物工程技術研究中心，福建 廈門 361021)

響應面優化酶法澄清琯溪蜜柚汁工藝研究

許 鍵1，蔡慧農1,2,3，倪 輝1,2,3，杜希萍1,2,3，黃高凌1,2,3

(1.集美大學生物工程學院，福建 廈門 361021； 2.福建省高校食品微生物與酶工程技術研究中心，福建 廈門 361021；3.廈門市食品與生物工程技術研究中心，福建 廈門 361021)

以琯溪蜜柚為主要原料，利用響應面法對酶法澄清琯溪蜜柚汁工藝進行優化.在單因素基礎上選取試驗因素與水平，根據 Box-Benhnken 試驗設計原理，采用三因素三水平的響應面分析法，對各個因素的顯著性和交互作用進行分析，以透光率為響應值作響應面曲線圖和等高線圖，并建立了工藝數學模型.結果表明：酶法澄清蜜柚汁工藝的最佳參數為果膠酶濃度200 U/mL、酶解溫度49 ℃、酶解時間40 min；并對結果進行驗證，在此條件下，蜜柚汁透光率為97.2%，與預測值97.5%接近.說明，根據Box-Behnken模型并采用響應面分析法得到的酶法澄清蜜柚汁優化工藝準確、可靠.

琯溪蜜柚汁；酶法澄清；優化；響應面

0 引言

澄清汁在保持果汁原有風味的基礎上，可使果汁產品的穩定性、色澤和外觀大大改善.因此，澄清果汁在果汁及飲料產品中占有越來越重要的地位[1].琯溪蜜柚由于果實品質好、皮薄多汁、清甜醇蜜、酸甜適中、成熟期早等諸多優勢而深受果農和消費者的歡迎，市場占有率逐年增加，目前已成為福建占領國內外市場的主要果品之一[2].琯溪蜜柚不僅是美味果品，更是天然的保健食品.據文獻[3-6]報道，每100 mL果汁含可溶性固形物10.7～11.6 g、糖9.17～11.6 g、酸0.73～1.0 g、維生素C 48.93～51.98 mg，同時含有鎂、鈣、銅、鐵、鋁、鈦、錳、釩、磷、氯等10多種對人體有益的礦物質元素.蜜柚果汁還含有大量的果膠，以及大量的纖維素、半纖維素等物質，這些物質能促進腸道蠕動，增強腸胃功能，降低血液中膽固醇的含量，起到保護心血管的功能.但這些物質也使得柚子汁加工過程中和保質期內易發生沉淀、絮凝等現象，影響產品的外觀和口感，從而嚴重影響了柚汁的商業價值.隨著蜜柚果汁脫苦加工技術的完善，柚子果汁生產中的澄清將是一個亟待解決的重要技術，也是蜜柚果汁加工的關鍵環節. 由壓榨方法制得的原果汁中出現的果實細胞碎片、一些不溶性成分和一些固體大分子物質(如多酚類物質、蛋白質、果膠、纖維素等)，這些物質將引起果汁渾濁，導致果汁在儲藏期間出現品質惡化，使果汁的貯藏期明顯縮短.文獻研究表明[7-8]，生產澄清果汁可以解決此問題.目前在果汁生產中常用的澄清方法主要有自然澄清法、離心分離法、熱處理法、冷凍法、酶法、澄清劑法和超濾法等[9-11].果膠酶是酶法澄清工藝中最常用的酶制劑，它能水解呈負電性的果膠物質，使果汁中其他大分子和帶正電顆粒失去果膠的保護作用，通過靜電平衡，和還沒有完全分解的帶負電的果膠分子凝聚，中和而沉淀，使之達到澄清凈化的效果[12].澄清型柚子汁及其飲料是國際市場需求的新動向，國內尚未見其開發應用的報道.本文研究了果膠酶用量、酶解溫度、酶解時間對琯溪蜜柚汁澄清效果的影響，通過響應面試驗優化確定酶解的最佳工藝條件.

1 材料與方法

1.1 材料

琯溪蜜柚，購自漳州市平和縣；商品果膠酶制劑(5×105U/g)，購自和氏璧生物技術有限公司.

1.2 儀器設備

HH-4 型恒溫水浴鍋，常山國華電器有限公司；Unic7200型紫外可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；101-3B型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海市實驗儀器總廠；BS223S型電子天平，賽多利斯科學儀器；LXJ-IIB型低速大容量離心機，上海安亭科學儀器廠.

1.3 方法

1.3.1 蜜柚澄清汁的制備 原料選擇→清洗→去皮→囊瓣分離、去囊衣→取囊瓣→打漿→壓榨擠汁→原汁→澄清→離心過濾→清汁備用.

1.3.2 離心澄清工藝 取蜜柚汁原汁5 mL，在25 ℃下于3000、3500、4000 r/min 離心，時間分別為5、10、15、20、25、30、35 min，取上層清液測定透光率，探討離心對蜜柚原汁澄清度的影響.

1.3.3 自然靜置澄清工藝 取蜜柚汁原汁5 mL，在25 ℃下分別靜置1，2，3，4，5 h，取上層清液測定透光率，探討靜置時間對蜜柚原汁澄清度影響.

1.3.4 蜜柚汁果膠酶澄清工藝 取蜜柚汁原汁5 mL，分別取果膠酶 100、200、300、400、500、600、700 U/mL ，在 25、30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃下 ，酶解15、30、45、60、75、90、105、120 min，煮沸10 min滅酶后冷卻備用.在單因素基礎上，以酶用量、酶解溫度和酶解時間為因素，采用響應面進行優化試驗，確定最佳酶解條件.

1.3.5 透光率測定 采用分光光度法.果汁經3000 r/min離心5 min，取上清液以蒸餾水作參比，比色杯厚 1 cm，在 660 nm 處測定果汁的透光率T.

1.4 數據分析

根據試驗所得蜜柚果汁透光率變化數據，采用Microsoft Excel 2010進行統計分析并繪圖；采用設計專家 Design-Expert 8.0.5 b軟件中的Response Surface程序進行響應面實驗設計，應用ANOVA程序進行方差分析，應用 Model Graph 程序作響應曲面圖和等高線圖，應用Optimization 程序中 Numerical 分析得預測最優值.根據試驗取得的數據建立回歸方程：Y=∑A0+∑AiXi+∑AiiXii+∑AijXiXj，式中：Y(透光率)為響應值；A0為常數項；Ai、Aii、Aij分別為一次項、平方項和交互項的回歸方程系數；Xi和Xj為自變量.

2 結果與分析

2.1 離心法澄清蜜柚汁試驗

由圖1可以看出，在室溫下離心處理前25 min內，蜜柚的透光率隨著離心時間的增加而升高的趨勢較為明顯，可能由于懸浮物在離心力的作用下迅速沉降，隨著離心時間的延長，懸浮物沉降得越多，透光率越高.但離心時間超過25 min 時，3000 r/min、3500 r/min 和 4000 r/min 條件下透光率上升趨勢都不明顯；另外，相同的離心時間時，蜜柚在 4000 r/min 的轉速下，透光率較高.所以，離心澄清效果最佳條件為轉速4000 r/min離心25 min，透光率為87.0%.

2.2 自然澄清法澄清蜜柚汁試驗

在果汁置于密閉容器中，經長時間靜置，使懸浮物沉淀.在靜置過程中，蛋白質和多酚類物質也可逐漸形成不溶性的沉淀，所以長時間靜置可以使果汁得到澄清.由圖2可知，當蜜柚汁不進行澄清時，透光率為30.8%.自然澄清時間在5 h之內時，隨著靜置時間的延長，透光率變化不大，在1 h時，透光率為48.4%，但之后透光率增加不顯著.但綜合考慮，此法仍達不到所需要的果汁澄清度.

2.3 酶法澄清蜜柚汁試驗

2.3.1 果膠酶濃度對澄清效果的影響

果膠酶濃度對蜜柚汁澄清效果的影響如圖3所示.由圖3可以看出，在45 ℃下果膠酶澄清處理蜜柚汁30 min，果汁的透光率得到較大的提高，果膠酶濃度對蜜柚汁澄清效果有顯著影響.果膠酶濃度從0增加到200 U/mL時，果汁透光率出現峰值.當果膠酶濃度超過200 U/mL時，隨著酶濃度的增加，果汁中的大部分果膠物質已經降解，果汁透光率逐漸趨于穩定.因此，響應面分析中果膠酶濃度因素水平分別選取100～300 U/mL.

2.3.2 酶解溫度對澄清效果的影響

圖4顯示的是在不同溫度下，200 U/mL果膠酶澄清處理蜜柚汁30 min的透光率.由圖4可見，當溫度為 50 ℃時，蜜柚汁的澄清達到最高，當溫度繼續升高，蜜柚汁的澄清度反而降低.這可能是由于溫度過高，果膠酶被鈍化而活性受抑制；同時過高溫度使少量的大分子沉淀物質重新溶解到蜜柚汁中，因此透光率呈現下降趨勢.因此，響應面分析中果膠酶作用溫度的因素水平選用45～55 ℃.

2.3.3 酶解時間對澄清效果的影響

由圖5可知，在50 ℃下200 U/mL果膠酶澄清處理蜜柚汁的前45 min，果汁的透光率隨時間的延長呈不斷上升趨勢；45 min后，果汁透光率的提高相對變緩.可能是因為隨著沉淀時間的延長，沉淀越來越緊實，體積變小，沉淀量不再增加，視為沉淀過程已經結束.但若作用時間過短，果膠酶對果膠的分解不完全，影響澄清效果.因此，響應面分析中果膠酶作用時間的因素水平選用30～60 min.

2.3.4 響應面法組合設計及試驗結果

表1 Box?Behnken試驗因素和編碼水平表Tab1 FactorsandlevelsofBox?Behnkenexperimentaldesign因素Factor編碼水平Codinglevel-10+1A酶濃度Enzymeconcentration/(U·mL-1)100200300B溫度Incubationtemperature/℃455055C時間Incubationtime/min304560

1)根據單因素試驗結果，取酶濃度、溫度、時間 3 個因素作為響應面中心組合設計的影響因子，確定出各因子的適宜水平，其試驗因素和編碼水平如表 1 所示.

2)酶解澄清試驗分析和回歸方程的建立.以蜜柚汁透光率為指標進行響應面優化實驗，采用 Design Expert 軟件[13-14]中Response Surface程序設計的試驗及優化的17 組試驗結果見表2.利用Design Expert 軟件中ANOVA程序對表 2 試驗數據進行方差分析及回歸系數顯著性檢驗，結果見表3和表4.回歸方程的方差分析顯示，模型的“Prob>F”為0.0011，說明該模型高度顯著.決定系數R2=0.9473，說明僅有約不到6%的果汁透光率數據不能用該模型解釋，失擬項P值為0.0779，失擬不顯著，說明方程擬合充分，預測值與實驗值之間有較高的相關度，可以用該回歸方程代替真實實驗點結果進行分析.

由表4可知，一元二次回歸方程為：Y=0.064A-0.05B-0.44C-0.100AB-0.13AC+0.3BC-0.69A2-0.52B2-0.69C2+ 97.46，方程中變量為編碼值.一次項除了C(時間)(P=0.0016)以外，A(酶濃度)(P=0.5009)、B(溫度)(P=0.588)都對結果無顯著影響；二次項中A2(P=0.0007)、B2(P=0.0037)、C2(P=0.0037)對結果有極顯著影響；交互項中BC(P=0.0469)交互作用顯著，其余交互項均不顯著，表明實驗因子對實驗響應值不是簡單的線性關系，而是呈二次關系，且三因素之間存在交互作用.方程中各項系數絕對值大小直接反映各因數對響應值的影響程度，系數的正、負反映影響的方向.依據系數估計值A=0.062、B= -0.050、C= -0.44，可知影響因子的主效應順序為：C>A>B.

表2 Box-Behnken試驗設計方案及結果

表3 回歸模型方差分析

變異來源Sourceofvariation平方和Sumofsquares自由度Degreesoffreedom均方MeansquareF值FvalueP值Pvalue模型Model7．80090．87013．970．0011殘差Residuals0．43070．062失擬Lackoffit0．34030．1104．960．0779誤差Error0．09240．023總和Sum8．24016R2=0．9473

表4 回歸模型系數的顯著性檢驗

3)響應面交互作用和回歸模型的優化.通過Design-Expert 8.0.5 b 軟件中 Model Graph 程序作出響應曲面圖和等高線圖，通過圖形可以直觀地展示響應值與實驗參數水平之間的關系.等高線的形狀可以反映交互效應的強弱，圓形表示兩個因素之間交互作用不顯著，橢圓形表示兩個因素交互作用顯著[15].通過觀察可以發現，果膠酶濃度與酶解溫度、酶解時間沒有顯著的交互作用，而酶解溫度與酶解時間有顯著的交互作用.圖6是以果膠酶濃度和酶解溫度為變量生產的響應面圖，從圖6中可以看出，當果膠酶處理時間為45 min時，隨著果膠酶濃度與果膠酶處理溫度的不斷增大，蜜柚果汁透光率呈現出先上升后下降的趨勢，當果膠酶濃度在200 U/mL、果膠酶處理溫度在50 ℃附近時，蜜柚果汁透光率有最大值.圖7是以果膠酶濃度和酶時間為變量生產的響應面圖，從圖7中可以看出，當果膠酶處理溫度為50 ℃時，隨著果膠酶濃度與果膠酶處理時間的不斷增大，蜜柚果汁透光率呈現出先上升后下降的趨勢，當果膠酶濃度在200 U/mL、果膠酶處理時間在45 min附近時，蜜柚果汁透光率有最大值.圖8所示2D圖形輪廓呈現橢圓形，結合分析結果中BC有較小的P值(0.046)，可見果膠酶處理溫度與果膠酶處理時間交互作用顯著，且當果膠酶濃度在200 U/mL時，在果膠酶處理時間在45 min、果膠酶處理溫度50 ℃附近，蜜柚果汁透光率有最大值.

4)最佳工藝條件確定與驗證.根據Design-Expert 8.0.5 b軟件的 Optimization 程序中 Numerical 分析，可得到該模型的最大估計值為98.5%，參數的最佳水平是：A(酶濃度)為200 U/mL，B(溫度)為49 ℃，C(時間)為40 min.在上述參數最優值的情況下，進行驗證，試驗結果分別為97.2%、97.1%、97.5%、97.3%、97.3%、97.1%，平均實測值(97.2±0.15%)與預測值97.5%相近，相對誤差在2%以下，證明應用響應面法優化果膠酶澄清蜜柚汁的關鍵因子是可行的，優化模型有較好可靠性.

2.4 幾種澄清方法的比較

由圖9可知:比較離心澄清、自然澄清和果膠酶澄清法對蜜柚汁澄清效果，以果膠酶澄清效果最好，所需時間也最短，澄清40 min 透光率就已達到 97.2%，分別比離心澄清法和自然澄清法高10.3%、48.9%.比較離心澄清和自然澄清，二者澄清效果有顯著性差異，在轉速4000 r/min下離心25 min后透光率達到87.0%，明顯高于自然澄清的.

3 結論

1)果膠酶法澄清蜜柚汁效果明顯優于離心澄清法和自然澄清法.在單因素實驗基礎上確定了果膠酶法響應面試驗設計的因素水平為酶濃度100～300 U/mL、酶解溫度45～55 ℃、酶解時間30～60 min.

2)通過試驗結果的方差分析及回歸系數顯著性檢驗可知，果膠酶法澄清蜜柚汁條件優化數學回歸模型為：Y=0.064A-0.05B-0.44C-0.100AB-0.13AC+0.3BC-0.69A2-0.52B2-0.69C2+97.46.采用此模型在本試驗范圍內能較準確地預測蜜柚汁的透光率.在本實驗范圍內，各因素對果膠酶法澄清蜜柚汁的影響作用大小順序依次為：酶解時間>酶濃度>酶解溫度.

3)果膠酶法澄清蜜柚汁的最佳工藝參數為酶用量 200 U/mL、酶解溫度49 ℃和酶解時間44 min，在此條件下，理論透光率達到97.5%，而實際測得的蜜柚汁的透光率為97.2%，與理論預測值的相對誤差小于2%.實驗值與理論值是吻合的，證明了該模型是合理可靠的.

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(責任編輯 馬建華 英文審校 曹敏杰)

Optimization of Enzymatic Clarification of Guanxi Pomelo Juice Using Response Surface Methodology

XU Jian1，CAI Hui-nong1,2,3，NI Hui1,2,3，DU Xi-ping1,2,3，HUANG Gao-ling1,2,3

(1.College of Biological Engineering，Jimei University，Xiamen 361021，China;2.Research Center of Food Microbiology and Enzyme Engineering Technology，Jimei University，Fujian Province University，Xiamen 361021，China;3.Research Center of Food Biotechnology of Xiamen City，Xiamen 361021，China)

To optimize the process for clarifying Guanxi pomelo juice，a series of single-factor experiments were made to investigate the effects of enzyme concentration，incubation time，incubation temperature on the clarity of the product.Based on single-factor experiments，a 17-run response surface design involving 3 factors at 3 levels was generated by the Design-Expert software according to the Box-Behnken design principle and experimental data thus obtained were subjected to quadratic regression analysis to create a mathematical model for clarification.The optimal enzyme clarification condition was using 200 U/mL of enzyme,and react at 49 ℃ for 40 min.Under these conditions，the clarity of pomelo juice reached 97.2%.This was similar to the estimated value of 97.5%.

Guanxi pomelo juice；enzymatic clarification;optimization；response surface methodology

2013-09-26

2013-11-05 [基金項目]國家自然科學基金資助項目(31371751)；福建省自然科學基金資助項目(2011J01225)；福建省教育廳項目(JA12188)；廈門市杰出青年人才基金項目(3502Z20126008)；集美大學科研創新團隊基金資助項目(2010A006)

許鍵(1988—)，男，碩士生，主要從事食品化學方向研究.通訊作者：黃高凌(1966—)，女，副教授，從事食品化學方向研究，E-mail:hgaol@jmu.edu.cn.

1007-7405(2014)02-0100-07

TS 255.44

A