促進劑對枯草芽胞桿菌CICC20958產肌苷的影響

游洪燕,楊 哲,肖安風,2,3,4 ,倪 輝,2,3,4,蔡慧農,2,3,4,楊秋明,2,3,4

(1.集美大學生物工程學院,福建 廈門361021;2.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室,福建 廈門 361021;3.福建省高校食品微生物與酶工程技術研究中心,福建 廈門361021;4.廈門市食品生物工程技術研究中心,福建 廈門361021)

促進劑對枯草芽胞桿菌CICC20958產肌苷的影響

游洪燕1，2,楊 哲1,肖安風1,2,3,4,倪 輝1,2,3,4,蔡慧農1,2,3,4,楊秋明1,2,3,4

(1.集美大學生物工程學院,福建 廈門361021;2.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室,福建 廈門 361021;3.福建省高校食品微生物與酶工程技術研究中心,福建 廈門361021;4.廈門市食品生物工程技術研究中心,福建 廈門361021)

根據肌苷的代謝調控機理，選擇檸檬酸鈉、NaF、CaCl2、次黃嘌呤、MnSO45種肌苷促進劑，考察它們的不同添加量對枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis,簡稱Bs)CICC20958菌株產肌苷的影響，采用均勻設計法得到最佳組合添加方案.結果表明，在促進劑檸檬酸鈉、NaF、CaCl2、次黃嘌呤、MnSO4質量濃度分別為7.9、0.001、0.032、2.1、0.2 g/L的條件下發酵，菌株Bs CICC20958的肌苷產量達到7.81 g/L，比不添加促進劑實驗組(對照組)的肌苷產量提高了5.38倍.

枯草芽胞桿菌；CICC20958；肌苷；促進劑；均勻設計試驗

0 引言

肌苷(Inosine)又名次黃嘌呤核苷，它是食品增鮮劑5′-肌苷酸鈉、呈味核苷酸二鈉的主要原料之一[1]，它在臨床上被廣泛用于心臟病、肝病、白血球減少癥、血小板減少癥等疾病的治療[2-4].枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis,簡稱Bs)主要通過糖酵解途徑(EMP途徑)和戊糖磷酸途徑(HMP途徑)進行分解代謝，提高葡萄糖代謝途徑中關鍵酶的活力以促進肌苷的合成.郭元昕等[5]在培養基中添加質量分數2%的葡萄糖酸鈣，使肌苷產量達到18.36 g/L，比不添加時提高70%.劉新星等[6]在發酵的基礎料中添加了質量分數0.2%的檸檬酸鈉，發現檸檬酸鈉的添加降低了EMP途徑中的6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的活力，使肌苷產量提高18%，肌苷對葡萄糖得率增加38%.Wu等[7]證明了在搖瓶培養基中加入0.2 ～0.5 g/L的檸檬酸可以顯著提高D-核糖產量，并在7 L發酵罐上進行了放大驗證.此外，在肌苷生產菌的發酵培養基中添加適量的前體物次黃嘌呤，使嘌呤堿基通過補救途徑直接合成核苷，從而也可以增加肌苷的生成量[8-10].Mn2+[11]、酵母粉[12]、MnSO4[13]、Na2MoO4[13]、CoCl2[13]等添加物同樣可促進肌苷的產量.本文選取了檸檬酸鈉、CaCl2、NaF、次黃嘌呤、MnSO45種促進劑添加到產肌苷的搖瓶發酵培養基中，在單因素的基礎上，再采用均勻設計方法優化促進劑組合添加的方案，探究這5種促進劑對Bs CICC20958產肌苷代謝過程中某些關鍵酶的影響，以及其如何促進肌苷產量.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

(NH4)2SO4、KH2PO4、MgSO4、CaCO3、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉等分析純試劑均購于國藥集團化學試劑北京有限公司；酵母膏購于上海華美生物公司；玉米漿(含47.5%干物質)由廈門匯盛生物有限公司提供；肌苷標準樣品購于美國Sigma公司；甲醇(色譜純) 購于美國天地公司.

1.2 培養基成分

1)斜面培養基(g/L) ：葡萄糖5，蛋白胨10，酵母膏5，氯化鈉2.5，瓊脂20，pH=7.2，0.1 MPa滅菌15 min.

2)種子培養基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母膏15，玉米漿12，氯化鈉2.5，尿素2，pH=7.2，0.1 MPa滅菌15 min.

3)初始發酵培養基(g/L)：葡萄糖150，酵母膏10，玉米漿12，尿素6，MgSO41，KH2PO32.5，氯化鉀1，pH=7.0，0.1 MPa滅菌15 min.

1.3 實驗方法

1) 菌種培養方法 將保藏菌種接種于斜面培養基，在37 ℃下活化18 h.從斜面取一環菌種，接種于含25 mL種子培養基的搖瓶中，在34 ℃、220 r/min下培養18 h.將培養好的種子液按5%的接種量加入到含25 mL發酵培養基的搖瓶中，34 ℃、280 r/min發酵72 h.

2) 生物量檢測 從搖瓶中均勻吸取0.1 mL發酵液，用蒸餾水梯度稀釋至80倍，在660 nm的波長下測吸光度值.

3)肌苷產量測定 參考文獻[14].從搖瓶中均勻吸取發酵液，離心后吸取上清液，用去離子水梯度稀釋50倍.稀釋后的樣品用0.22 μm膜過濾后，高效液相色譜法測肌苷濃度.

色譜條件為：Symmetry型C18反相柱(柱徑4.6 mm×150 mm)，流動相為水(質量分數0.5%磷酸)和甲醇，流速0.6 mL/min，波長248 nm，梯度洗脫.

4)菌株Bs CICC20958均勻試驗設計 在均勻設計試驗中，分別設檸檬酸鈉、NaF、CaCl2、次黃嘌呤、MnSO45個因素為自變量X1、X2、X3、X4、X5，肌苷產量為自變量Y，選擇五因素八水平的均勻設計模型(U8*(85))設計試驗.

5)試驗因素水平 將檸檬酸鈉、NaF、CaCl2、次黃嘌呤、MnSO45個因素，結合前期已經完成的單獨添加促進劑的結果，設計8個水平進行均勻設計優化.因素及水平設置見表1，按照均勻設計模型設計的具體試驗方案見表2.按表2所設計具體試驗方案進行肌苷搖瓶發酵，測得肌苷產量填入表2的響應值欄.

表1 U8?(85)因素及水平表Tab1 FactorslevelsbasedonU8?(85)g/L水平Levels因素FactorsX1X2X3X4X5110．0010．0041．00．025220．0020．0081．50．050330．0030．0122．00．075440．0040．0162．50．100550．0050．0203．00．125660．0060．0243．50．150770．0070．0284．00．175880．0080．0324．50．200表2 BsCICC20958均勻試驗設計和結果Tab2 ResultsofuniformdesignofBsCICC20958basedonU8?(85)g/L試驗號No因素FactorsX1X2X3X4X5響應值YResponsevalue110．0020．0164．00．2006．31220．0040．0323．00．1755．91330．0060．0122．00．1504．26440．0080．0281．00．1252．23550．0010．0084．50．1007．24660．0030．0243．50．0755．74770．0050．0042．50．0054．55880．0070．0201．50．0253．09

2 結果與討論

2.1 單一促進劑對菌株Bs CICC20958發酵和肌苷產量的影響

2.1.1 檸檬酸鈉對Bs CICC20958菌株發酵的影響 檸檬酸鈉是一種研究較多的促進劑，在提高肌苷產量方面可以達到很好的效果[15-17].在肌苷發酵的培養基中分別加入1、2、3和4 g/L的檸檬酸鈉，研究它們在肌苷發酵中對Bs CICC20958生物量及肌苷產量的影響，其結果如圖1所示.由圖1可以看出，添加0～3 g/L的檸檬酸鈉，生物量及肌苷產量隨著檸檬酸鈉添加量的增加而增加.當檸檬酸鈉質量濃度為3～4 g/L時，肌苷及生物量均呈現下降趨勢.在3 g/L檸檬酸鈉條件下，生物量為32.08，肌苷的產量最高達到1.92 g/L，其中肌苷產量較不添加檸檬酸鈉的空白組提高了53%.據報道，檸檬酸鹽可以增強枯草芽胞桿菌對Ca2+的吸收，而Ca2+是丙酮酸激酶的一種強烈抑制劑，當丙酮酸激酶活力下降時，會造成EMP途徑中的磷酸烯醇式丙酮酸大量積累，而磷酸烯醇式丙酮酸又是磷酸果糖激酶的強烈抑制劑.其次，磷酸果糖激酶是一種變構酶，檸檬酸鹽和ATP都對其有變構抑制的效果，胞內的檸檬酸鹽可以通過加強ATP的抑制效應來抑制磷酸果糖激酶.由此推斷，檸檬酸鈉可以同時降低枯草芽孢桿菌中心代謝途徑中的丙酮酸激酶和磷酸果糖激酶的活力，使EMP途徑的流量減弱[5].另外，檸檬酸合成酶是TCA循環的限速酶，添加檸檬酸鈉會競爭性抑制檸檬酸合成酶的活性[6]，所以添加適量檸檬酸鈉可以限制TCA代謝流量，減少碳架浪費.

2.1.2 CaCl2對菌株Bs CICC20958發酵和肌苷產量的影響 本試驗在肌苷發酵培養基中分別加入了0、0.005、0.01、0.015和0.02 g/L的CaCl2，考察其對肌苷產量及生物量的影響，實驗結果如圖2所示.由圖2可知，添加一定量的CaCl2可以有效促進肌苷的合成.當添加CaCl2質量濃度為0.01 g/L時，肌苷產量比不添加CaCl2的空白組提高32%.當CaCl2質量濃度大于0.01 g/L 時，生物量及肌苷產量和CaCl2添加量成反比關系.作為丙酮酸激酶的抑制劑，添加適量的Ca2+可以有效降低丙酮酸激酶的活力[5]，使EMP途徑中的磷酸烯醇式丙酮酸不斷積累，進而對磷酸果糖激酶產生相應的抑制作用.從結果中還可以發現，在CaCl2質量濃度為0.005～0.010 g/L時，隨著加入培養基中的CaCl2濃度的增大，生物量略有提高，但肌苷產量隨著CaCl2濃度的增加而迅速增加.Ca2+可以中和肌苷發酵過程中產生的有機酸等副產物，使發酵液的pH值維持在比較理想的水平，為菌體提供良好的生長環境.

2.1.3 NaF對菌株Bs CICC20958發酵和肌苷產量的影響 在肌苷發酵的培養基中加入0.001、0.002、0.003和0.004 g/L的NaF，考察其對肌苷發酵的影響，結果見圖3.由圖3可知，添加NaF對肌苷產量和菌體生長都具有一定的促進作用，但是高濃度的NaF則不利于肌苷的積累.從圖3中還可以看出，NaF質量濃度為0.003 g/L時，肌苷產量達到最高1.68 g/L，比不添加NaF的空白組提高35%.分析原因，可能是因為NaF具有抑制細菌產酸的作用，可以明顯減弱培養基pH值的下降，一般可以使pH值保持在6.2以上[18].因此隨著NaF添加量的增加，枯草芽孢桿菌的生物量呈現出不斷上升的趨勢.此外，氟化物是EMP途徑中烯醇化酶的強烈抑制劑，使該途徑的代謝流得到抑制，減弱了EMP途徑的通量，從而使得合成肌苷的代謝流增強，肌苷產量增加.

2.1.4 次黃嘌呤對菌株Bs CICC20958發酵和肌苷產量的影響 肌苷在枯草芽胞桿菌中的合成可以通過兩種不同的途徑來完成，即全合成途徑和嘌呤核苷酸的補救途徑[19].次黃嘌呤的添加可以為肌苷合成提供現成的嘌呤環，從而通過補救合成促進肌苷產量的提高.因此，本實驗考察了在培養基中分別添加0、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L的次黃嘌呤對肌苷產量的影響，結果見圖4.從圖4中可以看出，在考察范圍內，肌苷的產量與次黃嘌呤的添加量成正比關系.根據報道[20-21]，這可能是因為在肌苷的發酵生產中，補救途徑具有重要的功能，因為在其發酵的后期，各種營養成分的消耗會引起碳與氮之間比例的失調，以及pH值的改變，從而導致全合成途徑受到阻礙.此時，在培養基中添加嘌呤類物質可以啟動補救途徑，促進肌苷的持續合成.據對次黃嘌呤和肌苷分子質量的比較，1單位的次黃嘌呤理論上可以合成2單位的肌苷，這與本試驗中添加次黃嘌呤濃度2.5 g/L，肌苷產量增加4.58 g/L的結果相當，此時的肌苷產量是不添加次黃嘌呤空白組的4.66倍.

2.1.5 MnSO4對菌株Bs CICC20958發酵和肌苷產量的影響 在肌苷發酵培養基中嘗試加入0、0.025、0.05、0.075、0.1 g/L的MnSO4，考察其對肌苷發酵的影響，結果見圖5.從圖5中可以看出，添加適量的MnSO4確實可以提高肌苷的產量.當添加MnSO4質量濃度為0.05 g/L時，肌苷產量為1.65 g/L，比不添加MnSO4的空白組提高32%.因為Mn2+是微生物生長的必需元素，當培養基中缺少Mn2+時，不適合Bs的生長，但是會促進芽孢的形成，對肌苷產量有抑制作用[22]，加入MnSO4后可以為菌體繁殖提供更多的空間.又因為Mn2+在適當濃度時可以誘導6-磷酸葡萄糖脫氫酶，在HMP途徑中，肌苷合成的重要前體5-磷酸核糖即是6-磷酸葡萄糖在6-磷酸葡萄糖脫氫酶和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶相繼催化完成的[13]，所以添加適當濃度的MnSO4可以有效促進肌苷產量的增加.

2.2 菌株Bs CICC20958組合添加促進劑的均勻設計法優化

表3 BsCICC20958均勻試驗回歸方程顯著性分析Tab3 ResultsofregressionofBsCICC20958basedonuniformdesign因素Factors偏相關Partialcorrelationt-檢驗t-testP值PvalueX1?X1-0．33800．37630．0412X2?X2-0．98110．27000．0001X3?X3-0．21900．30760．6023X1?X2-0．80930．56530．0150X2?X5-0．48600．30720．0222X3?X50．08280．34060．8455

對于已獲得的試驗結果，通過DPS7.05軟件對結果進行分析，并采用二次多項式逐步分析得到肌苷產量(Y)對各個因素的回歸方程的顯著性分析(見表3)，所得到的回歸方程為：Y=6.1050+4.9668×10-2X1*X1-1.9170×104X2*X2-1.1467×103X3*X3-9.0327×10X1*X2-7.9151×102X2*X5+3.8487×102X3*X5，R2=0.9913，P=0.002439.可見，模型的P值小于0.05，說明該模型高度顯著；方程的相關系數R2=0.9913，說明僅有不到1%的肌苷產量變異不能用該模型解釋，預測值與實驗值之間有較高的相關度，可以用該回歸方程代替真實試驗點進行分析.由表3可知，各因素之間存在一定的交互作用，對于肌苷產量的影響大小排序為X2*X2>X1*X2>X2*X5>X1*X1>X3*X3>X3*X5.

通過軟件對回歸方程進行求導，可以得到各個因素的極值點，當這些極值點組合后，理論上肌苷產量達到最大值，各種促進劑的最佳參數見表4.

表4 各因子最優參數

在最優配方條件下進行均勻設計結果的驗證試驗，與不添加促進劑時的肌苷產量進行對比，結果顯示，通過均勻設計的試驗方法對添加促進劑組合的方案進行優化，并采用優化后的各促進劑的最佳參數進行驗證試驗，結果使肌苷產量達到7.81 g/L.相對于優化前不添加促進劑的肌苷產量1.22 g/L，優化后的肌苷產量提升了5.38倍，說明將均勻設計的試驗方法應用于肌苷發酵過程中促進劑組合添加方法的優化是可行的.

3 結論

本文分別考察了5種促進劑在不同濃度下對Bs CICC20958發酵產肌苷的影響，得到5種促進劑單獨添加時的最佳質量濃度(g/L)分別為：檸檬酸鈉3，CaCl20.01，NaF 0.003，次黃嘌呤2.5，MnSO40.05.在此基礎上，采用均勻設計方法優化促進劑組合添加的方案，結果顯示，當同時添加檸檬酸鈉7.9 g/L、NaF 0.001 g/L、CaCl20.032 g/L、次黃嘌呤2.1 g/L、MnSO40.2 g/L時，可以使肌苷產量達到最大值.經驗證，在此條件下該菌株的產肌苷能力與不添加促進劑相比提高了538%，達到7.81 g/L.

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(責任編輯 馬建華 英文審校 曹敏杰)

Effect of Accelerators on Inosine Production ofBacillussubtilisCICC20958

YOU Hong-yan1,2,YANG Zhe1,XIAO An-feng1,2,3,4,NI Hui1,2,3,4,CAI Hui-nong1,2,3,4,YANG Qiu-ming1,2,3,4

(1.College of Biological Engineering,Jimei University,Xiamen 361021,China;2.Fujian Provincial Key Laboratory of Food Microbiology and Enzyme Engineering,Xiamen 361021,China;3.Research Center of Food Microbiology and Enzyme Engineering Technology of Fujian Province,Xiamen 361021,China;4.Research Center of Food Biotechnology of Xiamen City,Xiamen 361021,China)

According to the regulating mechanism of inosine synthesis,some kinds of effective additives(sodium citrate,NaF,CaCl2,hypoxanthine and MnSO4) were added inBacillussubtilisCICC20958.Then,the best composition of accelerators was obtained by uniform design.The results showed that optimized combination increased inosine production to 7.81 g/L in the presence of 7.9 g/L sodium citrate,0.001 g/L NaF,0.032 g/L CaCl2,2.1 g/L hypoxanthine and 0.2 g/L MnSO4.The yield of inosine was 5.38 times higher than that of the control group.

Bacillussubtilis；CICC20958；inosine；accelerator；uniform design

2013-09-17

[修回日期]2013-12-18 [基金項目]福建省自然科學基金資助項目(2011J01225);集美大學中青年創新團隊專項基金項目(2010A006)

游洪燕 (1989—) ,女,碩士生,從事發酵工程方向研究.通訊作者：楊秋明(1977—) ,男,高級實驗師,從事微生物方向研究,E-mail ：yangqm@jmu.edu.cn.

1007-7405(2014)02-0107-06

Q 936

A