響應面法優化金銀花中黃酮類物質提取條件

關炳峰，王 永，郭良起，李向力

(河南省商業科學研究所有限責任公司，河南鄭州450002)

金銀花含有多種對人體有利的植物活性成分，如綠原酸、異綠原酸、木犀草素等黃酮類化合物，具有抗衰防癌、輕身健體的良好功效。黃酮類物質的提取方法有水提法、乙醇提取法、超聲波提取法、酶解醇提法等［1－4］。周春暉等［5］研究了水提法的工藝條件，李榮等［6］以總黃酮得率為指標，用乙醇法進行了提取工藝優化，李曉軍［7］等研究了超聲波法提取對金銀花中黃酮類物質的影響?？偟膩碚f，水提法節省資源，但是得率低，并且雜質比較多，后續處理困難。超聲波提取法局部產生較高的溫度導致活性物質喪失活性，且生產成本高，很難適應工業化大規模生產的需求，因此不適宜采用。酶法在提取的同時可能與金銀花中的其他物質發生反應，而降低了活性物質的提取量，而且酶的價格也比較昂貴，限制了酶解提取法在工業生產上應用。而乙醇提取法有成本低、得率高、對環境污染小等優點。

本文以乙醇為溶劑，采用響應面法優化了金銀花中黃酮類物質提取條件，為工業化生產提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金銀花(水分含量1.00%，灰分含量6.31%)由浙江省溫州市瑞安九譚金銀花加工基地提供，金銀花干花粉碎，過40目篩，密封保存;蘆丁標準品武漢市華順生物技術有限公司;乙醇、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁 均為分析純。

SD－250渦輪式粉碎機 浙江省嵊縣特種粉碎設備廠;UV－265 FW型紫外可見分光光度計 日本島津公司;RE52－99旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 單因素實驗 以干燥粉末(水分含量為1.00%)為原料，稱取2.000g樣品，放到50mL燒杯中，加入乙醇，在電熱恒溫水浴鍋中恒溫加熱一定時間，收集上部液體，重復加熱提取。將液體真空抽濾，將濾液置于離心機中以4200r/min離心30min取出，在真空旋轉蒸發儀中濃縮至乙醇含量很少(以不能聞出酒精味為宜)，將濃縮液倒入50mL的容量瓶中，用蒸餾水定容。

按表1條件進行提?。?］，提取后用分光光度法來測定并計算提取率，分析乙醇濃度、提取溫度、料液比、提取時間、提取次數和提取液pH這6個因素對提取率的影響。

表1 提取條件的因素和水平表Table 1 Factors and levels of extraction

1.2.2 響應面法優化實驗設計［9－14］以單因素實驗確定響應面法設計實驗的因素與水平，在料液比1∶15、提取次數3次、pH自然條件下，選取乙醇濃度X1、提取溫度X2、提取時間X3三個因素，設計三因素二次回歸旋轉正交組合方案表2。

表2 二次回歸正交旋轉組合設計因素編碼表Table 2 Factors and levels ofdual quadratic rotary combination design

1.2.3 金銀花中黃酮類物質的測定 準確稱取干燥至恒重的蘆丁標準品0.0224g于100mL容量瓶中，95%乙醇溶解，搖勻，定容。取 0、2、4、6、8mL 標準品溶液于25mL比色管中，加5%亞硝酸鈉溶液1mL，搖勻，放置6min，加10%硝酸鋁溶液1mL，搖勻，放置6min，加10%氫氧化鈉10mL，加水至刻度，搖勻，靜置15min，在510nm波長處測定吸光度，以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，制作標準曲線［15］。將實驗中測得的吸光度直接代入該公式，可以直接得到提取液中黃酮類物質的含量。

金銀花中黃酮提取得率(mg/g)=金銀花總黃酮提取液凍干后的質量/金銀花粉末質量

1.2.4 數據處理 利用SAS軟件，對設計的三因素二次回歸旋轉正交進行數據處理，并進行二次多元回歸擬合，并考察3個因素之間的交互作用。

2 結果與分析

2.1 金銀花中黃酮類物質提取單因素實驗結果

選擇溫度60℃、料液比為1∶15、提取時間為2h、提取次數為3次，提取pH為7，研究乙醇濃度對提取率的影響。由圖1可以看出，隨著乙醇濃度的增大，黃酮類物質的含量不斷升高。在乙醇的濃度達到60%前，黃酮類物質的得率隨乙醇濃度的升高提高較快;當乙醇濃度大于60%后，黃酮類物質得率的增加速率明顯變慢。因此，選擇乙醇濃度為60%。

圖1 乙醇濃度對提取的影響Fig.1 Effect of alcohol concentration on extraction

選擇乙醇濃度為60%，其他條件不變，研究溫度對提取率的影響。由圖2可以看出，在60℃前黃酮類物質的得率隨溫度升高而升高，到達60℃時，黃酮類活性物質具有最高得率，而當溫度高于60℃時，黃酮類物質的得率降低。當溫度升高到一定程度時，金銀花中黃酮類物質因溫度高而發生變化，從而影響了黃酮類物質的提取。因此，選擇提取溫度為60℃。

圖2 提取溫度對提取的影響Fig.2 Effect of temperature on extraction

選擇乙醇濃度為60%、溫度60℃，其他條件不變，研究料液比對提取率的影響。由圖3可以看出，開始時黃酮類物質得率的增長較快，而在料液比為1∶20時，增長速度明顯變慢?？梢娫谝欢ǚ秶鷥忍崛∪軇┑脑龆?，可以使黃酮類物質提取率增加，但是當提取溶劑增加到一定程度時，黃酮類物質的提取已經達到飽和，提取率增長速度就會變慢。因此，選擇料液比是 1∶20。

圖3 料液比對提取的影響Fig.3 Effect of ratio of solid to liquids on extraction

選擇乙醇濃度為60%、溫度60℃、料液比為1∶20、提取時間為2h、提取pH不變，研究提取次數對提取率的影響。由圖4可以看出，隨著提取次數的增多，所獲得的黃酮類物質是不斷增多的，但是當提取次數達到3次以上時，黃酮類物質的得率增長速度變慢?？梢?，多次提取可以提高對金銀花中黃酮類物質的提取，但是當提取次數到一定程度時，金銀花中黃酮類物質的提取已經接近飽和，所以提取率的增長就會變小。因此，選擇的提取次數為3次。

圖4 提取次數對提取的影響Fig.4 Effect of extracting times on extraction

選擇乙醇濃度為60%、溫度60℃、料液比為1∶20，其他條件不變，研究提取時間對提取率的影響。由圖5中可以看出，從1h開始，隨著提取時間的增長，黃酮類物質的提取量增加，當提取時間到達2h后，黃酮得率開始明顯降低?？梢?，隨著提取時間的延長，對黃酮類物質的提取不利。因此，選擇的提取時間為2h。

圖5 提取時間對提取的影響Fig.5 Effect of extracting time on extraction

選擇乙醇濃度為60%、溫度60℃、料液比為1∶20、提取時間為2h、提取次數為3次，研究提取pH對提取率的影響。圖6中可以看出，黃酮類物質的得率具有不規律性，當提取溶液pH為6時，黃酮類物質的得率最高，其它pH時，黃酮類物質的得率變動較大。當提取溶液的pH從7向酸堿兩個方向移動時，黃酮類物質總的得率不斷減少?？梢?，當提取溶液的pH呈現較強的酸性或堿性時，金銀花中的黃酮類物質會因為pH的變化而發生一定的化學反應或本身性質發生變化，而不易被提取出來。因此，選擇的提取pH為7。

2.2 旋轉正交實驗結果

按照三因素二次旋轉正交回歸設計方案，制備出23組浸提樣，分別測定黃酮類物質的含量，用標準曲線y=11.088x－0.0002(R2=0.9999)計算結果。實驗結果見表3:

圖6 溶液pH對提取的影響Fig.6 Effect of pH value on extraction

利用SAS軟件，對表3數據進行分析，剔除不顯著因素和不顯著的交互作用，得到黃酮類物質的含量隨乙醇濃度、提取溫度、提取時間的標準回歸模型為:Y=128.68X0－4.39X1－5.00－4.23

2.3 回歸模型的檢驗

利用SAS軟件，對表3數據進行分析。由表4可以得知，在顯著水平α=0.01時，回歸方程式F檢驗顯著，說明回歸方程與實際情況擬和較好。F檢驗反映的是回歸模型的有效性，由表4可知，回歸模型達到極顯著水平，表明回歸模型能夠較好地描述各因素與響應值的關系。

表4 回歸方差各項的方差分析Table 4 Coding coefficients for the independent variable

由表 5 T－檢驗結果表明，X2、X3、X1X2、X1X3和X2X3的回歸系數不顯著，因而原方程可以簡化為:Y=128.68X0－4.39X1－5.00－4.23。根據各變量的顯著性檢驗可以得出三個單因素的主次關系:乙醇濃度＞提取溫度＞提取時間。通過SAS分析得到最佳工藝:乙醇濃度為65%、提取溫度為65℃、提取時間1.75h。

表5 T－檢驗結果Table 5 The result of T－test

2.3.1 雙因素交互作用對提取量的影響 由圖7可見，乙醇濃度X1和提取溫度X2有交互作用，在單因素對黃酮類物質提取的結果中，黃酮類物質的提取量隨乙醇濃度的提高而增大;而由于乙醇濃度X1和提取溫度X2有交互作用，使提取量出現一個峰值。因而提取金銀花中黃酮類物質，乙醇濃度X1和提取溫度X2不能升高過度。由圖8可見，乙醇濃度X1和提取時間X3有交互作用。低濃度較長時間和低濃度較短時間的提取量相差不多，同一濃度隨時間的延長提取量會先高后低。而提取時間過高長會影響提取量和提取物的性質。由圖9可見，提取溫度X2和提取時間X3有交互作用，當提取溫度X2和提取時間X3都增大時，提取量也增大，當達到一定值時，提取量就有所下降。

表3 二次回歸正交旋轉組合設計實驗安排及結果表Table 3 Testing scheme and results of dual quadratic rotary combination design

圖7 乙醇濃度(X1)和提取溫度(X2)對提取量(Y)的影響Fig.7 Effect of alcohol concentration and extracting temperature on extraction

2.3.2 模型的驗證 在乙醇濃度為65%、提取溫度為65℃、提取時間1.75h、料液比是1∶20、提取次數為3次、提取pH為7條件下進行驗證實驗，平行3次實驗，驗證實驗結果分別為 128.21、129.04、128.55mg/g，平均值為128.60mg/g，相對誤差為0.85%，與預測值較為接近，證明響應面分析法得到的金銀花中黃酮類物質提取條件是可行的。

圖8 乙醇濃度(X1)和提取時間(X3)對提取量(Y)的影響Fig.8 Effect of alcohol concentration and extracting time on extraction

圖9 提取溫度(X2)和提取時間(X3)對提取量(Y)的影響Fig.9 Effect of extracting temperature and extracting time on extraction

3 結論

通過單因素實驗和旋轉正交實驗設計，金銀花中黃酮類物質的最佳提取工藝條件為:乙醇濃度為65%、提取溫度為65℃、提取時間1.75h、提取3次、料液比為1∶15、pH為7。在此優化的工藝條件下金銀花中黃酮類物質的提取量達到128.60mg/g。

［1］Meng D S，Wang S L.Antitumor effect of quercetin［J］.ChinTra－dit Herb Drugs，2001，32:186－188.

［2］王發國，葉華谷，馬其俠，等.金銀花及其藥理作用［J］.生物學通報，2004，39(5):17－18.

［3］丁利君，吳振輝，蔡創海，等.金銀花中黃酮類物質最佳提取工藝的研究［J］.食品科學，2002，23(2):62－66.

［4］胡普輝，楊雪紅.中國金銀花發展現狀及對策探討［J］.陜西農業科學，2009(5):104－106.

［5］周春暉，李俊.β－環糊精輔助提取金銀花中總黃酮的工藝研究［J］.中成藥，2010，32(10):1796－1798.

［6］李榮，胡成穆，彭磊，等.正交設計研究金銀花總黃酮提取工藝［J］.安徽醫科大學學報，2006，41(4):410－412.

［7］李曉軍.超聲波輔助提取金銀花中黃酮類化合物的研究［D］.西安:陜西師范大學，2009:33.

［8］楊俊，張曉靜，田麗娟，等.金菊雙花總黃酮提取與純化工藝研究［J］.中藥材，2005，28(8):703－705.

［9］余家林.農業多元實驗統計［M］.北京:北京農業大學出版社，1993:111－123.

［10］魏安池，代紅麗.響應面分析法優化紅花黃色素提取工藝條件［J］.食品與機械，2006，22(2):11－13.

［11］關炳峰，譚軍，周志娣.金銀花提取物的抗氧化作用與其綠原酸含量的相關性研究［J］.食品工業科技，2007，28(10):127－129.

［12］董發明，白喜婷.響應面法優化超聲提取杜仲雄花中黃酮類化合物的工藝參數［J］.食品科學，2008，29(8):227－231.

［13］何德貴，周芳勇，李仕先，等.金銀花不同提取工藝及優選條件探討［J］.中國實驗方劑志，2001，7(1):6－7.

［14］陳蓉，吳啟南.響應面法優化芡實種皮多酚的提取工藝研究［J］.食品工業科技，2013，34(13):205－210.

［15］凌關庭.抗氧化食品與健康［M］.北京:化學工業出版社，2005:324－344.