核因子IA在神經角質細胞瘤中的表達及與患者生存的關系

姜洪剛，寧桂蘭，鄭景輝 (.廣西梧州市桂東人民醫院神經外科，廣西 桂東 54300;.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院，廣西 5300)

膠質瘤是最常見的原發性中樞神經系統腫瘤，占人類所有原發性顱內新生物的40% ～50%［1］。在各年齡組的發病率和死亡率都很高，但是對其預后的研究仍然較少［2～4］。傳統膠質細胞瘤，依靠細胞形態學或細胞培養來分類［5］。據世界衛生組織(WHO)的分類系統，神經膠質瘤可細分為星形細胞瘤，少突膠質細胞，或混合少突膠質細胞等。專一位點DNA結合蛋白(也被稱為CTF或CATT box轉錄因子)的核因子I(NFI)家族在神經系統的發育中具有關鍵調節作用［6－7］。NFIA是NFI值家族的成員之一，在鼠類和鳥類心室發育中具有關鍵的作用已經被證明。并且已知NFI基因在大鼠的腦和脊髓星形膠質細胞分化中具有關鍵調節作用，其機制可能是通過轉錄調控的膠質纖維酸性蛋白(GFAP)的表達來發揮作用［8］。此外，在出生后的小鼠大腦中切除NFIA或NFIB，中線的神經膠質細胞群就會產生發育缺陷［9］。事實上，NFIA在人胎兒前腦的中線結構中也表達［10］。NFI基因在神經膠質細胞的發育過程中，表現出動態的表達方式［11］。在胚胎角質的發生過程中，NFI基因的表達在所有膠質前體的發展過程中，他們在少突膠質細胞系中發生轉錄抑制，他們的表達維持了星形膠質細胞的特征。這樣的模式，有可能被用來識別存在沿軸線不同點分化的細胞。此外，NFIA參與神經膠質發展的事實表明，它可能會在神經膠質腫瘤發生改變，甚至可能在腦膠質瘤發展中發揮重要作用。因此，我們檢測可能在膠質瘤中發揮作用的NFIA，我們分析了神經膠質腫瘤的NFIA在表達及其與患者的生存之間的關系。我們的數據顯示，高表達NFIA蛋白的星形細胞瘤患者其生存期較長，表明NFIA在人腦星形細胞瘤的生物學活動中可能發重要作用。

1 材料與方法

1.1 組織標本：這項回顧性研究分析了從2007年～2012年間在我院的116例患者病理標本。病理審查后，8例保存不當的腫瘤材料被剔除在外。余下的108例可利用組織樣本包括82例人腦膠質瘤(61例星形細胞瘤，17例少突膠質細胞瘤，以及4例少突－星形細胞瘤)，16例非角質細胞腫瘤(聽神經瘤、腦膜瘤，神經鞘瘤，淋巴瘤，每組4例)，和10例從癲癇外科手術或尸體解剖切除非腫瘤性腦組織。其中高級別星形細胞瘤25例兒科患者。

1.2 免疫組織化學染色：使用免疫組化染色的方法檢查NFIA的表達，使用NFIA和GFAP雙標記免疫組織化學方法進行。對標本進行石蠟包埋，脫石蠟后，熱抗原修復20 min，使用以下抗體：NFIA1：3 000(兔多克隆抗體，)和 GFAP1：50(小鼠單克隆的 IgG1，DAKO)。NFIA多克隆抗體是針對人NFIA 478－492氨基酸的。一抗使用兔IgG作為陰性對照。根據標準程序，進行蘇木精和曙紅(HE)染色。

1.3 免疫組織化學染色分析：使用Image Pro Plus6.0軟件，由同一病理學科醫生獨立進行盲法分析，按照WHO的診斷分級標準對樣品先進行病理診斷。NFIA表達的量化分析由2個研究者獨立進行分析。通過計算切片視野中NFIA陽細胞的數量占總細胞數另估比值來確定NFIA的定量表達。(視野倍率×400，每個切片3個視野，至少包含200腫瘤細胞)。NFIA染色細胞作為NFIA－表達細胞。由于內皮細胞缺乏NFIA免疫反應性被用來作為內部背景陰性對照。兩個分析者讀數的平均值用于統計分析。

1.4 PFS：PFS定義為自診斷之日起，最小時間間隔的日期腫瘤的復發，進展或最后的隨訪。

1.5 數據分析：患者的生存分析采用(Kaplan－Meier)方法，NFIA的表達各組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，使用SPSS16.0進行分析。

2 結果

2.1 NFIA的在正常大腦星形膠質細胞中的表達：我們采用免疫組化的方法分析正常腦組織表達，確定是否正常人類的星形膠質細胞中也有表達NFIA。結果發現，NFIA在正常的人大腦皮層表達較多(圖1－A)，而在白質中表達較少(圖1－B)。值得注意的是，NFIA染色的細胞表現星形膠質細胞的特征，與少突膠質細胞比較，具有較大的胞核和豐富的胞漿，NFIA和GFAP的雙染細胞(分化的星形膠質細胞標記)顯示在正常的大腦皮層，NFIA是主要表達在GFAP陽性細胞上(圖1－C)。這些數據表明，在正常的人類大腦皮層，NFIA主要表達在細胞星形膠質細胞譜系。

圖1 A大腦皮層，B白質C NFIA(褐色)和GFAP(猩紅色)雙染在星形膠質細胞(×400)

2.2 NFIA在膠質細胞瘤中的表達：在胚胎發育過程中，NFIA主要表現在星形膠質細胞系的細胞，但少量表達在少突膠質細胞系。因此，比較NFIA在非星形膠質瘤中的表達：61例星形膠質細胞和16例少突膠質細胞瘤和16例非角質細胞作比較。我們發現只有具有星形膠質細胞特征的細胞高表達NFIA(圖2－A)。反之，少突膠質細胞不表達NF1A的(圖2－B)。NFIA在少突膠質細胞瘤細胞的定量分析表明，平均只有7.25%表達NFIA(。其表達顯著低于星形細胞瘤的表達(P＜0.01，表1)。同樣，在我們觀察的非角質腦腫瘤(神經鞘瘤，淋巴瘤和腦膜瘤，共4例其他類型的腫瘤)，NFIA也有3%左右的腫瘤細胞表達(圖2－C)。綜上所述，這些數據表明，雖然NFIA在星形細胞瘤中高表達，它是在少突膠質細胞瘤和在非角質腦瘤中也有少量表達。

2.3 NFIA在惡性星形細胞瘤中的表達與PFS的關系：我們進一步將NFIA的表達按高低分為相等的三個組，根據患者PFS做了生存分析，結果顯示三組的中位生存時間分別是69、41、44個月，P=0.036＜0.05。NFIA高表達組生存率較高與PFS明顯的呈單變量復相關(圖3)。

表1 NFIA在各種細胞中的表達

圖2 NFIA在各種細胞中的表達(×400)

圖3 NFIA在惡性星形細胞瘤中的表達與PFS的關系生存率曲線圖

3 討論

NFIA是一種在小鼠和鳥類的胚胎發育過程中早表達、決定星形膠質細胞的命運的轉錄因子。本次研究的目的是評價角質細胞命運的決定因素NFIA在人類神經角質細胞瘤與一般腦腫瘤和非神經膠質細胞瘤中的表達。盡管我們的數據提示NFIA參與星形角質細胞的生物學過程，但是其機制尚未明確。因為NFIA是神經膠質細胞胚胎發育過程中必須的。這是一個基于遺傳和細胞背景的復雜作用機制，NFIA的表達的具體作用體現在不同的亞型［12－13］。值得注意的是在雞的胚胎成纖維細胞NFIA是不致癌的，并且它的表達有助于細胞抗致癌基因引起的細胞分化。比如說jun，fos和myc基因(所有編碼轉錄的因子)［14］，再次說明了其抗癌的作用。但是這些表達NFIA的雞細胞又容易在胞質中致癌基因作用下分化如src，raf，ras基因，說明它通過不同的信號轉導通路扮演著不同角色。發生以上情況的原因可能是很多亞型的不同作用，正如WT1一樣最初是在腫瘤抑制基因中發現，但是在另一個亞型里面，后來發現又具有促癌作用［15－16］。另外遺傳背景也能發揮重要作用，在確定抗癌/促癌功能方面，這些已得到證明，如myc和ras甚因，它們p53表達時候誘發凋亡，當p53缺失促進轉化［17－19］。NFI能在p53啟動子位置聯合啟動p53基本功能的一種鋅指蛋白，他能促進如c－myc或抑制如c－fos等其他啟動子［20］。

尋找從少突膠質細胞腫瘤區分星形細胞瘤的標記，長期以來一直是神經病理學家和神經腫瘤學家的目標。然而，如Olig2和STAT3，這被認為是作用于神經膠質瘤的形成的標記，都同樣表達在星形細胞瘤和少突膠質細胞，限定了他們的診斷價值［21－22］。因此，我們的觀察NFIA表達在所有級別的星形細胞瘤，但只有少量表達在少突角質細胞瘤，并估計未來的研究可能會發現NFIA是一個區分這兩個神經膠質腫瘤有用的診斷標記。

支持上述說法，少量的少突膠質細胞腫瘤的初步檢查顯示，細胞NFIA的表達和少突膠質細胞標記的細胞表達，Olig2是相互排斥的(數據未顯示，未發表的數據)。NFIA是優先表達在星形膠質細胞，少突膠質細胞與發育階段的表達模式，這些數據是一致的。有趣的是，在脊髓發育的某些階段，Olig2對抗NFIA促進星形膠質細胞的分化，并且NFIA對Olig2的抑制似乎依賴于兩種蛋白的相對水平。另外，Olig2可以轉錄抑制NFIA表達。在Olig2 2/2小鼠，有一個脫抑制NFIA表達，這表明在少突膠質細胞Olig2可能轉錄抑制NFIA表達的。當然還需要更全面的研究，以確定是否NFIA可能是有用的診斷星形膠質細胞的標記，以區分腦星形細胞瘤，少突膠質細胞腫瘤的情況下，尤其是形態學很難評估的時侯。

我們證明NFIA在星形細胞瘤中的蛋白表達與更長的PFS顯著相關，盡管這是一個相對較小樣本的分析。較大規模的多中心研究將可以確定是否NFIA可能是一個潛在的星形細胞瘤的預后指標。Scrideli等通過實時定量PCR檢測20例GBM NFIA mRNA的表達高于10個非腫瘤性樣品白質超過13倍，遺憾的是但沒有檢查其與PFS或OS的關系。

我們的免疫組織化學結果表明，GBM的細胞表達NFIA在分數是高于在正常腦組織，Scrideli等在蛋白質水平證實了NFIA在雞胚成纖維細胞中的表達，使它們能夠抵抗核內癌基因的激活，這個結果可能暗示我們實驗結果的相關機制。NFIA在雞胚成纖維細胞的保護作用說明其可以保護細胞免受進一步轉變事件。然而它的損失是暴露細胞使其惡性變的可能性增加?？傊?，我們的數據表明，星形細胞瘤NFIA蛋白的表達改善 PFS有明確的關系。這也支持 REMBRANDT GBM芯片分析數據庫。這些發現，與現有的知識相結合，表明NFIA可能在星形細胞瘤生物學中具有重要的作用。

同時值得注意的是我們發現在GBM中與非血管周圍腫瘤細胞相化NFIA蛋白是高度濃縮在血管周圍的腫瘤細胞的浸潤性腫瘤邊界，這提示我們在星形膠質細胞瘤中，NFIA參與(或促進或抑制)腫瘤細胞做浸潤和轉移。與此同時，黏附分子ephrin B1和鈣粘蛋白也被證實是NFIA的目標［23］。這值得進一步深入研究。

［1］ 路俊鋒，吳勁松．腦膠質瘤腫瘤標志物的研究進展［J］．中國神經腫瘤雜志，2009，7(3)：210．

［2］ 羅 飛．WHOⅢ級膠質瘤患者放療或聯合化療治療的預后因素分析［J］．重慶醫科大學學報，2012，37(11)：976．

［3］ Sanai N，Berger MS．Glioma extent of resection and its impact on patient outcome［J］．Neurosurgery，2008，62(4)：753．

［4］ 是 旌，王 峰．惡性腦膠質瘤手術聯合放療預后及相關因素分析［J］．軍醫進修學院學報，2012，33(10)：1067．

［5］ Louis DN，Ohgaki H，Wiestler OD，et al．The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system［J］．Acta Neuropathol，2007，114(2)：97．

［6］ Deneen B，Ho R，Lukaszewicz A，et al．The transcription factor NFIA controls the onset of gliogenesis in the developing spinal cord［J］．Neuron，2006，52(6)：953．

［7］ Gronostajski RM．Roles of the NFI/CTF gene family in transcription and development［J］．Gene，2000，249(1 －2)：31．

［8］ Cebolla B，Vallejo M．Nuclear factor－I regulates glial fibrillary acidic protein gene expression in astrocytes differentiated from cortical precursor cells［J］．J Neurochem，2006，97(4)：1057．

［9］ das Neves L，Duchala CS，Tolentino － Silva F，et al．Disruption of the murine nuclear factor I－A gene(Nfia)results in perinatal lethality，hydrocephalus，and agenesis of the corpus callosum［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1999，96(21)：11946．

［10］ Steele － Perkins G，Plachez C，Butz KG，et al．The transcription factor gene Nfib is essential for both lung maturation and brain development［J］．Mol Cell Biol，2005，25(2)：685．

［11］ Ren T，Anderson A，Shen WB，et al．Imaging，anatomical，and molecular analysis of callosal formation in the developing human fetal brain［J］．Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol，2006，288(2)：191．

［12］ Ling G，Hauer CR，Gronostajski RM，et al．Transcriptional regulation of rat CYP2A3 by nuclear factor 1：identification of a novel NFI－A isoform，and evidence for tissue－selective interaction of NFI with the CYP2A3 promoter in vivo［J］．J Biol Chem，2004，279(27)：27888．

［13］ Xie Y，Madelian V，Zhang J，et al．Activation of the NPTA element of the CYP2A3 gene by NFI－ A2，a nasal mucosa－selective nuclear factor 1 isoform［J］．Biochem Biophys Res Commun，2001，289(5)：1225．

［14］ Schuur ER，Kruse U，Iacovoni JS，et al．Nuclear factor I interferes with transformation induced by nuclear oncogenes［J］．Cell Growth Differ，1995，6(3)：219．

［15］ Hohenstein P，Hastie ND．The many facets of the Wilms'tumour gene，WT1［J］．Hum Mol Genet，2006，15(Spec 2)：R196．

［16］ 胡文婷，羅長纓，湯靜燕．兒童急性白血病WT1基因表達的臨床意義［J］．臨床兒科雜志，2008，26(8)：655．

［17］ Serrano M，Lin AW，McCurrach ME，et al．Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and p16INK4a［J］．Cell，1997，88(5)：593．

［18］ 胡文婷，羅長纓，湯靜燕．兒童急性白血病WT1基因表達的臨床意義［J］．臨床兒科雜志，2008，14(8)：655．

［19］ Henriksson M，Selivanova G，Lindstrom M，et al．Inactivation of Myc－induced p53－dependent apoptosis in human tumors［J］．Apoptosis，2001，6(1 －2)：133．

［20］ Furlong EE，Rein T，Martin F．YY1 and NF1 both activate the human p53 promoter by alternatively binding to a composite element，and YY1 and E1A cooperate to amplify p53 promoter activity［J］．Mol Cell Biol，1996，16(10)：5933．

［21］ Ligon KL，Alberta JA，Kho AT，et al．The oligodendroglial lineage marker OLIG2 is universally expressed in diffuse gliomas［J］．J Neuropathol Exp Neurol，2004，63(5)：499．

［22］ Wang H，Zhang W，et al．Analysis of the activation status of Akt，NFkappaB，and Stat3 in human diffuse gliomas［J］．Lab Invest，2004，84(8)：941．

［23］ Wang W，Mullikin － Kilpatrick D，Crandall JE，et al．Nuclear factor I coordinates multiple phases of cerebellar granule cell development via regulation of cell adhesion molecules［J］．J Neurosci，2007，27(23)：6115．