蘇拉明對小鼠肺腺癌的抑制作用及對血清VEGF和MMP－9表達的影響

賀兼斌，張貽秋，向 志，唐建新，許霞輝，張 平 ［.湖南省懷化市第一人民醫院(南華大學附屬懷化醫院)呼吸內科，湖南 懷化 48000;.南華大學附屬第一醫院呼吸內科，湖南 衡陽 400］

近年來，由于城市工業化、農村城鎮化、環境污染的加速，特別是煙民的增加，肺癌的發病率及死亡率都明顯升高，而肺腺癌血管豐富，生長快，轉移早，預后極差，是預后最差的惡性腫瘤之一。血清中細胞因子檢測在非小細胞肺癌(Nonsmall cell lung carcinoma，NSCLC)的研究中越來越受到人們的注意，細胞因子的檢測能有效地監測療效和評價腫瘤的生長與轉移，同時以抗血管為靶點的抗腫瘤治療亦成為研究熱點。蘇拉明是一種合成的六萘酸脲陰離子化合物，既往的研究表明他對肺腺癌生長有明顯的抑制作用［1］，但具體的作用機制尚不十分清楚，本研究筆者構建肺腺癌小鼠移植瘤模型，以DDP為陽性對照，觀察蘇拉明對肺腺癌移植瘤生長和轉移的影響，通過檢測血清中血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)和基質金屬蛋白酶－9(Matrixmetalloproteinase－9，MMP－9)的表達以探討其抗瘤機制?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、細胞株、藥品及試劑：C57BL/6J小鼠24只，雌雄各半，體重(20±2)g，購自中國醫學科學院腫瘤醫院實驗動物中心，許可證號：SCXK11－00－0005，由南華大學腫瘤研究所提供SPF級飼養環境。Lewis肺癌(鼠源)由中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心提供，順鉑購于江蘇豪森藥業股份有限公司(生產批號：040605)，蘇拉明購于美國Sigma公司，小鼠 VEGF酶聯免疫吸附測定(Enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒為美國Bio Sources公司產品，小鼠MMP－9 ELISA試劑盒為美國R＆D system公司產品。

1.2 動物模型的建立：處死兩只荷瘤種鼠(接種Lewis肺癌(鼠源)細胞)，無菌條件下剝離皮下瘤體，剪去瘤體表面的血管、結締組織以及內部壞死組織，使用NaCl溶液沖洗，剪碎后放入勻漿器，研磨瘤組織成為細胞懸液，滴加NaCl溶液調節細胞密度至1×107/ml，各小鼠右腋下接種0.2 ml細胞懸液(含細胞數目2×106個)形成小鼠動物腫瘤模型。

1.3 分組及用藥：24只小鼠皮下移植處均成瘤，接種后第4天開始藥物干預。將24只C57BL/6J小鼠隨機分為三組：荷瘤對照組、順鉑組、蘇拉明組。每組8只，雌雄各半。對照組，NaCl溶液 0.2 ml/只腹腔注射(ip)，1次/d;順鉑組，順鉑4 mg/(kg·d)溶于NaCl溶液0.2 ml中ip，于接種后第4天、第11天、第18天各1次，并予NaCl溶液0.2 ml/只每天腹腔注射1次;蘇拉明組，蘇拉明10 mg/(kg·d)溶于 NaCl溶液0.2 ml中ip，1次/d，腫瘤接種24天處死全部小鼠。

1.4 觀察指標及方法

1.4.1 腫瘤生長的觀察：用藥期間每隔2天用游標卡尺測量小鼠皮下腫瘤最大長徑(a)和橫徑(b)，計算腫瘤體積，平均瘤體積=a×b2/2。腫瘤接種24天處死全部小鼠，剝離皮下腫瘤稱重，計算各組藥物的抑瘤率，抑瘤率=(對照組瘤重－實驗組瘤重)/對照組瘤重×100%。

1.4.2 腫瘤轉移的觀察：實驗結束后，剖胸觀察雙肺表面腫瘤轉移情況，將肺臟浸泡于Boins液(4%中性甲醛溶液占70%，冰醋酸占5%，苦味酸過飽和液占25%)24 h，待肺轉移瘤結節突起后計數肺部表面轉移結節數，計算肺表面結節轉移抑制率：轉移抑制率(%)=(1－用藥組平均轉移結節數/對照組平均轉移結節數)×100%。

1.4.3 VEGF及MMP－9的檢測：用酶聯免疫吸附法(En zyme－linked immunosorbent assay，ELISA)檢測 VEGF及 MPP－9，將經眼球靜脈叢取出的各組小鼠血液樣本1 ml經4℃保存過夜后10 000×g離心10 min，收集上清(血清)，采用小鼠ELISA試劑盒測定各組小鼠血清VEGF、MMP－9表達情況，具體檢測方法嚴格參照試劑盒說明書進行，在450 nm處讀取吸光度值，VEGF、MPP－9的測定分別按照試劑盒提供的標準試劑所得到的標準曲線進行測定，計算出各檢測孔中VEGF(pg/ml)、MPP－9(ng/ml)的濃度值。

2 結果

2.1 腫瘤生長情況：腫瘤接種后的第1～4天，接種處成瘤率為100%，移植瘤生長基本相同，各組皮下移植瘤的體積逐漸增大，成局部結節狀生長，后期18～24天，對照組移植瘤生長明顯快于其他組，蘇拉明組腫瘤生長最慢，處死后解剖觀察見腫瘤質硬，表面有血管生長分布，以對照組明顯，各用藥組對移植瘤生長均有抑制作用。各組腫瘤體積，質量及抑瘤率見表1，各組腫瘤見圖1。

表1 各組小鼠腫瘤生長情況的比較(±s)

表1 各組小鼠腫瘤生長情況的比較(±s)

注：與對照組比較，①P＜0.01

組別 例數 皮下腫瘤體積(x ± s，cm3)?皮下腫瘤重量(x ± s，g)腫瘤抑制率(%)對照組8 5.471±1.520 5.009±1.041 0順鉑組 8 3.932±1.352① 3.046±1.027① 39.20①蘇拉明組 8 2.893±0.513① 2.549±0.433① 49.11①

圖1 各組腫瘤的生長情況

2.2 腫瘤轉移情況：肺轉移結節數：各用藥組均明顯低于對照組，差異有統計學意義，蘇拉明組肺轉移結節明顯減少(P＜0.01)，小鼠肺轉移發生率：蘇拉明組8只小鼠中有6只發生轉移，低于對照組和DDP組(8只全部轉移)，轉移抑制率的比較：蘇拉明組與其他各組比較轉移抑制率明顯升高，差異有統計學意義(P＜0.01)，肺濕重比較隨轉移結節數減少而降低，蘇拉明組與其他各組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，轉移情況見表2，肺轉移結節見圖2。

表2 各組小鼠肺轉移情況的比較(±s)

表2 各組小鼠肺轉移情況的比較(±s)

注：與對照組比較，①P＜0.05;②P＜0.01

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圖2 腫瘤的肺轉移情況

2.4 血清 VEGF及 MMP－9檢測：對照組和DDP組血清VEGF的表達為強陽性，蘇拉明組同對照組及DDP組相比VEGF表達減小(P＜0.01)，所有各組血清MPP－9均陽性表達，蘇拉明組與對照組和DDP組相比較，MMP－9的表達明顯減少(P＜0.01);而DDP組與對照組相比差異無統計學意義，各組VEGF和MPP－9表達見表3。

表3 各組小鼠血清中VEGF和MMP－9表達情況的比較(±s)

表3 各組小鼠血清中VEGF和MMP－9表達情況的比較(±s)

注：與對照組比較，①P＜0.01

組別 例數 VEGF(pg/ml) MMP－9(ng/ml)對照組8 431.15±27.38 223.47±21.50順鉑組 8 401.96±25.51 208.12±17.29蘇拉明組 8 135.35±19.05① 89.02±7.51①

3 討論

目前，中晚期肺癌患者的預后仍然很差，Ⅱ～Ⅳ期患者的5年生存率僅在15%左右［2］。肺癌患者的預后和臨床分期緊密相關，由于肺癌的臨床表現缺乏特異性，多數肺癌患者在確診時已經是中晚期，從而失去了外科手術機會，放化療為其綜合治療的主要方法，而新近對惡性腫瘤的治療目標轉移到控制腫瘤血管的生成，從而抑制其生長和轉移［3］。肺腺癌作為肺癌的一種組織學類型其發病率在迅速上升，該類肺癌癌瘤內血管豐富、生長快、手術機會少、預后極差，尋找與肺腺癌進展相關的指標對肺腺癌的靶向治療有重要意義，已成為國內外學者研究的熱點，開發抑制其生長和轉移的藥物已成為一項重要課題。血液腫瘤標志物具有檢測方便、易于重復的特點，對判斷腫瘤的進展及預后具有重要的意義，近年來蘇拉明抗腫瘤作用逐漸受到矚目［1，4－5］，本課題觀察蘇拉明對肺腺癌生長和轉移的抑制作用及通過檢測血清VEGF和MMP－9的表達探討及抗腫瘤機理。

腫瘤的生長、浸潤及轉移是一個復雜的過程，離不開新生血管和淋巴管生成，研究已經證實［6－7］，腫瘤的生長及轉移早期即需要血管生成，以滿足腫瘤生長所需要的營養，在大多實體腫瘤中，都存在異常的血管生成。VEGF是一種多功能糖蛋白，是體內最強、特異性最高的一種血管生長因子，是刺激血管內皮細胞增殖和移行的重要因子，也是已知最強的血管通透劑，通過增加血管內皮細胞的有絲分裂和促使血管內皮細胞的遷移，促使病理性血管生成，而腫瘤血管的生成有利于腫瘤細胞浸潤淋巴管，促進腫瘤向淋巴結轉移，由于VEGF特異性地作用于血管內皮細胞，參與實體瘤的血管新生，與實體瘤的侵襲和轉移等生物學特性密切相關［8］。近年來，血清中細胞因子檢測在非小細胞肺癌的研究中越來越受到人們的注意，隨著腫瘤的發展，惡性腫瘤細胞常常分泌大量的細胞因子，造成惡性腫瘤的異常增殖，細胞因子的檢測能有效地監測療效和預防復發，酶聯免疫法在NSCLC患者血清中蛋白水平的測定有可能替代腫瘤組織中mRNA的檢測，為那些無法取得腫瘤組織或取到腫瘤組織較困難的患者提供更快捷、簡便的檢測方法，為臨床選擇治療方法及判斷預后提供依據，血清VEGF濃度水平能夠反映癌組織VEGF的表達情況，認為檢測血清中VEGF的水平可反映惡性腫瘤血管生成的活性程度，可作為判斷肺癌患者預后的獨立指標，對判斷腫瘤生長及轉移、腫瘤負荷、治療反應及預后等有一定的臨床指導意義［9］。本研究中，對照組血清中VEGF表達明顯升高，其血清濃度高達(431.15±27.38)pg/ml，而其腫瘤生長快，肺內轉移結節多，使用藥物干預后，在順鉑組中，血清VEGF表達略有下降，腫瘤生長受到抑制，腫瘤轉移亦受到抑制，但對腫瘤轉移的抑制作用較輕，而蘇拉明能明顯下調肺腺癌小鼠血清VEGF的表達，其濃度下降至(135.35±19.05)pg/ml，腫瘤的生長和轉移都受到明顯的抑制，其抑瘤率為49.11，而肺表面轉移結節數為6.00±1.70，較對照組(14.00±2.90)和順鉑組(9.77±1.65)都明顯下降，腫瘤轉移抑制率為 57.15，較順鉑組(30.25)明顯升高，說明蘇拉明可能能通過下調肺腺癌小鼠血清VEGF的表達，抑制腫瘤的血管生成，從而抑制腫瘤的生長和轉移，我們既往的研究亦表明蘇拉明能下調肺腺癌腫瘤組織內VEGF的表達［10］，與本研究的結果一致，順鉑作為肺癌的一線化療藥物，亦能抑制肺癌的生長和轉移，但對轉移的抑制作用較弱，可能與順鉑主要為細胞毒作用有關。在腫瘤的發生及發展的各個環節中，都伴有多種腫瘤侵襲及轉移相關基因的表達異常，這可能是細胞惡變過程中獲得侵襲和轉移能力的重要原因，而腫瘤的侵襲和轉移的關鍵是基底膜的破壞和細胞外基質(Extracellular matrix，ECM)的降解，腫瘤細胞從原發灶脫落后，必須突破ECM和基底膜組成的屏障結構，才能向周圍組織侵襲，從而進入血液循環或淋巴系統，形成遠隔器官轉移或淋巴結轉移［11］。惡性腫瘤細胞能產生多種蛋白水解酶，基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)是一種重要的蛋白水解酶家族，他是一類鋅離子依賴性肽鏈內切酶，其成員超過24種，通過降解細胞外基質(Extracelular matrix，ECM)及基底膜(Basement membrane，BM)在腫瘤生長、浸潤及轉移中起重要作用［11－12］。其中MMP－9是目前發現的與腫瘤侵襲關系最為密切的一種基質金屬蛋白酶，在病理情況下，他能夠降解構成基底膜主要支架的Ⅳ型膠原和包繞腫瘤的基質及一些非基質成分，為其生長及轉移提供空間及通道，改變腫瘤細胞的微環境，突破組織基質屏障，促進腫瘤的侵襲和轉移［13－14］;本研究中，對照組肺腺癌小鼠血清中MMP－9呈高表達狀態，腫瘤轉移率明顯增加，肺轉移結節數最多，為14.00±2.90，經蘇拉明干預后，MMP－9的表達明顯下調，與對照組及順鉑組皆有顯著性差異，而腫瘤的轉移亦受到明顯抑制，轉移結節數為(6.00±1.70)，轉移抑制率高達57.15%，與其他兩組比較差異有統計學意義，提示蘇拉明可能通過下調MMP－9的表達阻止了腫瘤的侵襲和轉移。當然腫瘤的生長、侵襲和轉移是一個多步驟、多因素作用的結果，有研究表明MMP－9另一方面能通過促進VEGF的釋放參與調節毛細血管增生和促進新生血管生成，促進腫瘤的生長和擴散［15］。

綜上所述，蘇拉明對小鼠肺腺癌的生長和轉移有明顯抑制作用，其作用機制可能通過下調VEGF和MMP－9的表達，抑制腫瘤新生血管形成，阻止基底膜的降解，從而抑制腫瘤的生長、侵襲和轉移。筆者選擇血清學指標可能與腫瘤組織中相應蛋白表達一致，具有取材容易，檢測方便，便于重復等優點，將受到人們的關注。鑒于腫瘤的發病機制極為復雜，對于蘇拉明抗瘤作用更為詳盡的機制有待進一步研究。

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