大鼠大腦皮層星形膠質細胞不同體外培養方法對GFAP表達的影響

蘇玲 高秀利

【摘 要】目的：比較體外培養純化星形膠質細胞的不同方法對星形膠質細胞影響，為進一步研究奠定基礎。方法：原代培養后分別經振蕩純化、傳代純化的方法培養星形膠質細胞。結果：原代培養的星形膠質細胞純度不高；經振蕩純化后GFAP表達量明顯增多，GFAP免疫熒光變亮；經傳代純化培養后純度達到97%，GFAP表達量較少。結論：經過傳代純化的星形膠質細胞純度較高，GFAP表達量較少，因此能更好地反映其在腦中的功能，是研究星形膠質細胞在腦中的功能較好的培養方法。

【關鍵詞】星形膠質細胞；體外培養；膠質纖維酸性蛋白

【中圖分類號】R-311 【文獻標識碼】A 【文章編號】1004-7484（2014）06-3494-01

【Abstract】Objective： Comparing different ways of isolation and purify astrocytes from mouse cerebral tissue to Learn the effect of astrocytes for future study of their functions in the brain. Methods： To acquire purified astrocytes by two usually used cultural methods： after primary culture， subculture for three times or shanken overnight twice. Results： The purity of primary culture was the lowest ，with the method of being shanken over night twice highly expressed GFAP， Immunofluorescence staining with anti-mouse GFAP was brighter. Astrocytes purified by being subcultured for three times over 97% purity. The expression of by GFAP low. Conclusion： With the subcultural method we can acquire the purer astrocytes in vitro， which the expression of by GFAP lower， and can best reflect their functions in the brain. Its an optimal method to acquire the astrocytes for future study of their functions in vivo.

【Key words】astrocyte； in vitro； glial fibrillary acidic protein

反應性星形膠質細胞及星形膠質細胞與神經元的關系一直以來都是神經科學界關注的熱門課題[1]，體外分離純化星形膠質細胞己有三十余年的歷史，為眾多研究提供了實驗基礎，也大大促進了對Ast的特性研究。雖然獲取星形膠質細胞的方法較多，但一般研究偏重星形膠質細胞的純度而較少關注其生物學特性。而不同的體外培養方法可能影響Ast活化，表現為GFAP不同程度的表達，進而可能影響實驗結果，本研究將文獻常報道的兩種方法進行比較，觀察不同試驗方法對GFAP表達影響，從而獲得一種純度既高，又能滿足不同實驗要求的星形膠質細胞純化方法。

1 材料與方法

1.1 材料 SD乳鼠（泰山醫學院實驗動物中心）；DMEM/F12粉劑（Gibco產品）；兔抗人GFAP多克隆抗體（北京中杉金橋）；Cy3標記抗兔IgG免疫熒光試劑盒（碧云天生物技術研究所）；細胞核染色劑DAPI（碧云天生物技術研究所）； Image-proplus4.0圖像分析系統（IPP公司）。

1.2方法

1.2.1 星形膠質細胞純化培養 選用SPF級、出生時間不超過48 h的健康SD乳鼠，75%乙醇浸泡消毒后，處死、取出大腦移入含有預冷的D-Hanks液培養皿中，洗滌并去除腦膜，夾取少許大腦皮層組織D-Hanks液中洗滌、剪碎，0.125%胰蛋白酶消化后終止，過濾、離心，棄上清，重新加入培養基，制成單細胞懸液，接種到培養瓶中，差速粘附處理2次。再次制成單細胞懸液，接種至預先用多聚賴氨酸包被過的培養瓶中， 37℃、5%CO2培養箱培養， 7～9 d后，細胞已80% ～90%融合，進行傳代培養。

1.2.2 傳代培養時按以下兩種方法進行星形膠質細胞培養： （1）培養10～12 d，在搖床上以180 r/min振蕩過夜一次（DMEM基培， 37°C，18 h）， 隔天再以同樣的方法振蕩第二次，此為 “振蕩純化”；以后每4 d傳一代（不再做震蕩純化），共傳三次，每次傳代不做差速貼壁，實驗取傳三代（即第四代）的星形膠質細胞，終密度為1×106/ml左右，于傳代后7 d進行實驗。 （2）原代培養（3d換液一次）第12天開始，每4 d傳一代，共傳三次，每次傳代均差速貼壁0. 5 h，實驗取傳三代（即第四代）的星形膠質細胞，終密度為1×106/ml左右，于傳代后7 d進行實驗，此為“傳代純化”。

1.2.3 星形膠質細胞鑒定 將蓋玻片置于六孔培養板內，種入不同方法純化的Ast傳代培養3代的細胞，每種方法12個標本，待細胞長至約為50%～80%滿，4%多聚甲醛固定，洗滌；加入封閉液封閉60 min，洗滌；用稀釋50倍兔抗人GFAP一抗作用60 min，去除一抗，洗滌3次，每次5 min；加入1毫升稀釋500倍的Cy3標記的IgG二抗，避光作用60 min，洗滌后加入1 ml濃度為1μg.ml-1 的DAPI，避光作用30 min，洗滌后加一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細胞的蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察到紅色的熒光及藍色熒光分別為GEAP染色與核染色。每個標本隨機取3個視野，分別計數紅色及藍色熒光個數，以紅色/藍色百分比表示純化純度，取平均值記錄。

1.2.4 細胞GFAP表達的檢測 接種24h后，4%多聚甲醛固定，洗滌；加入封閉液封閉60 min，洗滌3次，每次5 min；用稀釋50倍兔抗人GFAP一抗作用60 min，洗滌加入稀釋500倍Cy3標記的IgG二抗，避光作用60 min，洗滌（同上）；滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細胞的蓋玻片。在熒光顯微鏡下（200倍），每個標本隨機取3個視野，用圖像采集處理系統記錄每個視野的熒光強度值，以平均熒光強度值表示該標本的GFAP表達相對水平。

1.3統計學方法 應用SAS8.1統計軟件進行數據分析，計量資料實驗數據采用均數±標準差（ ）表示。兩變量采用t檢驗，P <0.05認為差異有統計學意義。

2結果

傳代后，星形膠質細胞胞體較大而扁，形狀不規則，胞質較豐富，細胞核圓形或卵圓形，常偏于胞體的一側，內有1～2個核仁，經GFAP特異性標記抗體的免疫熒光染色以及DAPI染色后，熒光顯微鏡觀察可見：兩種培養方法特異性染色的GFAP亮度不同，但統計分析示：GFAP陽性細胞率震蕩純化為（98.3±0.9）%、傳代純化為（97.0±1.1）%（P > 0.05），（見圖1，圖2）。提示不同的培養方法對Ast的純化沒有影響。

3討論

在中樞神經系統中，膠質細胞是主要的組成部分，其中星形膠質細胞（Ast）在中樞神經系統中發揮著多種作用。在受到一定程度的刺激時，星形膠質細胞會表現出胞體變大，突觸變長，交織成網的“反應性星形膠質細胞”的形態特征，并伴隨著一系列功能改變，包括膠質纖維酸性蛋白（GFAP）表達增強，而GFAP免疫反應增強表明Ast被活化。相對于在體研究，體外分離培養的Ast具有許多優點：Ast分離、純化培養比較容易，在培養基中生長穩定，不容易發生自發轉化，保持了在體情況下的生理功能和對外界因素刺激的良好反應性；純化培養的Ast既無神經元存在，又消除了在體情況下各種因素對Ast的影響，Ast對損傷的反應基本干擾因素也比較容易控制，有利于進行機制研究的單因素分析。因此，采用體外培養的方法對Ast進行研究就成為神經科學研究者致力的一個方向。如何獲取高純度的星形膠質細胞，并且使其在正常離體培養過程中不被誘導為反應性星形膠質細胞，是研究其在腦內功能的前提。本研究將對文獻常報道的兩種方法進行觀察、比較。

原代培養時，我們盡量選用剛出生的乳鼠，一般不超過48小時，此時腦皮質的Ast處于分裂增殖的高峰期，培養細胞易于成活；取材時在解剖顯微鏡下務求盡量去除腦膜和血管。這樣即可以提高Ast的成活力，還可以有效預防成纖維細胞、血細胞、內皮細胞的污染；有文獻報道最主要污染的細胞為貼附能力很強的成纖維細胞與小膠質細胞[2]，只有通過反復的傳代和預貼壁才能有效除去， 我們的實驗是在“原代培養”的基礎上，繼續傳代培養。

傳代時，我們采用不同的方法，觀察對GFAP表達的影響，在“震蕩純化”傳代培養中，以200 r/min的速率在恒溫震蕩器上作用后酶消化傳代。與直接酶消化法相比，經恒溫震蕩后，可以有效地除去少突膠質細胞[3] ，因為少突膠質細胞呈半粘附狀態附著于星形膠質細胞之上，通過震蕩可以去除，增加膠質細胞的純化率。同時也避免了采用柱過濾的方法對星形膠質細胞的損傷[4] ，傳代后，純化獲得的星形膠質細胞其反應性標志物GFAP的表達量大量增加， GFAP免疫熒光亮度增高，提示細胞已經處于“活化”階段。在“傳代純化”的方法中，我們也獲得較為純化的星形膠質細胞，傳三代后的星形膠質細胞純度可達97%，兩種傳代培養方法所獲得的星形膠質細胞純度沒有統計學意義。但與“震蕩純化”相比：其GFAP熒光強度值明顯降低（p<0.01），提示傳代純化對星形膠質細胞活化影響較低。有利于在離體的研究中觀察星形膠質細胞的功能變化。

總之，用“傳代純化”獲取星形膠質細胞能有效去除其他細胞的污染，達到97%以上的純度，對某些對GFAP表達或星形膠質細胞活化有特除要求的離體研究，可提供滿足實驗要求的純化星形膠質細胞株。

參考文獻

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[2] Tabernero A， Orfao A， Medina JM. Astrocyte differentiation in primary culture followed by flow cytometry[J].Neurosci Res， 1996， 24（2）： 131-138.

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[4.] Schneider B， Mutel V， Pietri M，et al. NADPH oxidase and extracelluar-regulated kinases 1/2 are targets of prion protein signaling in neuronal and nonneuronal cells[J]. PNAS， 2003， 100：13326-13331.