用正交設計法優化地錦草中總黃酮的超聲提取工藝

張海英，張 紅（新疆醫科大學附屬中醫醫院藥學部，烏魯木齊830000）

［本文編輯］蘭 芬

地錦草為大戟科植物地錦（EuphorbiahumifusaWilld.）或斑地錦（EuphorbiamaculataL.）的干燥全草，具有清熱解毒、涼血止血、利濕退黃、增強肝脾功能的作用，用于治療痢疾、泄瀉、皮膚瘙癢、瘡癤癰腫等疾?。?］。地錦草資源十分豐富，全草含黃酮類（槲皮素等）、沒食子酸、內消旋肌醇等活性成分。提取地錦草中的黃酮類成分常采用加熱回流法，該方法具有溶劑消耗量大、加熱時間長的缺點。超聲提取法利用超聲波的空化作用、機械效應和熱效應等加速細胞內有效物質的釋放、擴散和溶解，具有快速、安全、效率高等優點。超微粉碎是指利用機械或流體力學的途徑將物料粉碎至粒徑＜10μm微粒的過程，超微粉末具有良好的溶解性、分散性、吸附性和化學反應活性等特殊理化性質［2］。本研究將地錦草藥材超微粉碎后，用超聲提取法提取其中的總黃酮，采用單因素實驗結合正交試驗設計，優化地錦草中總黃酮的提取工藝條件。

1 材 料

1.1 儀器 SYFM－8型超微粉碎振動磨（濟南松岳機器有限責任公司）；Cintra－20紫外－可見分光光度計（澳大利亞GBC科學儀器公司）；SK3300LH超聲清洗器（上?？茖С晝x器有限公司）。

1.2 藥品和試劑 地錦草購于新疆自治區維吾爾醫院，經新疆醫科大學附屬中醫醫院李永和主任中藥師鑒定為地錦草（EuphorbiahumifusaWilld.）；蘆丁對照品（批號100080－200707，中國食品藥品檢定研究院）；亞硝酸鈉（分析純，天津市福晨化學試劑有限公司）；硝酸鋁、95%乙醇、石油醚（天津市百世化工有限公司）；氫氧化鈉（分析純，上?；瘜W試劑集團公司）。

2 方法和結果

2.1 溶液的配制（1）蘆丁對照品溶液：精密稱取蘆丁對照品10.0mg，置50ml量瓶中，加95%乙醇適量，超聲10min使溶解，加95%乙醇定容，即得0.2mg／ml的蘆丁對照品溶液。（2）供試品溶液：地錦草藥材經超微粉碎振動磨粉碎15min，得到超微粉末。精密稱取10g地錦草超微粉末，將95%乙醇加適量蒸餾水稀釋成70%濃度，用70%乙醇溶液100ml超聲提取60min，并補足減失的重量。濾紙過濾，濾液用石油醚脫色后置250ml量瓶中，用70%乙醇定容，即得。

2.2 最大吸收波長的選擇 精密量取供試品溶液和蘆丁對照品溶液各2ml，置25ml量瓶中，加70%乙醇至6ml，加4%亞硝酸鈉溶液1ml，搖勻，放置6min。加10%硝酸鋁溶液1ml，搖勻，放置6min，加10%氫氧化鈉溶液10ml，用70%乙醇定容至刻度。放置15min使反應完全，在紫外－可見分光光度計下400～700nm掃描，確定最大吸收波長為500nm。

2.3 方法學考察

2.3.1 標準曲線的制備 分別精密量取蘆丁對照品溶液1、2、3、4、5、6ml置25ml量瓶中，加95%乙醇5、4、3、2、1、0ml使至6ml，按2.2項下自“加4%亞硝酸鈉溶液1ml”開始操作，以95%乙醇作為空白對照，用紫外－可見分光光度計在500nm處測定吸光度（A）［3］。以濃度（c）為橫坐標，A為縱坐標進行線性回歸，得到標準曲線方程：A＝12.814c＋0.004 5（r＝0.999 9），表明蘆丁在8～48μg／ml范圍內線性關系良好。

2.3.2 精密度實驗 精密吸取蘆丁對照品溶液2ml，按2.2項下操作測定含量，重復測定6次。計算得到RSD＝1.23%（n＝6），表明該方法精密度良好。

2.3.3 加樣回收率實驗 精密稱取9份已知總黃酮含量為6.18mg／g的地錦草超微粉末5g，按2.1項下方法（2）制備供試品溶液。將供試品溶液置于25ml量瓶中，每3份精密加入濃度為0.2mg／ml的蘆丁對照品溶液0.5、1.0、1.5ml，70%乙醇定容至刻度，得到低、中、高濃度分別為4、8、12μg／ml的混合樣品溶液。按2.2項操作測定吸光度，計算加樣回收率，結果低、中、高濃度的加樣回收率分別為（99.23±1.21）%、（100.79±1.76）%、（99.47±2.14）%（n＝3）。

2.3.4 重復性實驗 稱取10g地錦草超微粉末，共5份，按2.1項下方法（2）制備供試品溶液，測定吸光度，根據標準曲線方程計算得到總黃酮的平均含量為（6.18±0.11）mg／g，RSD＝1.78%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.3.5 穩定性實驗 精密量取供試品溶液2ml，按2.2項下操作，在溶液配制后2h內每隔15min測定1次吸光度，計算得到RSD＝1.21%（n＝9），表明供試品溶液在配制后2h內穩定。

2.4 單因素實驗 采用單因素實驗對超聲提取法的乙醇濃度、乙醇用量、提取時間、提取次數等因素進行考察?？疾炷硞€因素時，其他影響因素固定不變，評價該因素對提取效果的影響。

2.4.1 提取工藝的評價指標 提取工藝評價指標是總黃酮含量和浸膏得率的綜合評分，其中總黃酮含量和浸膏得率的權重系數分別是60和40?？傸S酮含量評分＝（總黃酮含量／最大總黃酮含量）×60，浸膏得率評分＝（浸膏得率／最大浸膏得率）×40，綜合評分＝總黃酮含量評分＋浸膏得率評分。

2.4.2 乙醇濃度的影響 分別用濃度為10%、30%、50%、70%、90%的12倍體積的乙醇溶液為溶媒進行提取，每次提取時間為1h，提取次數為2次，計算綜合評分。結果用10%和30%的乙醇提取時，綜合評分幾乎相同，分別為（30.4±0.9）和（31.2±1.2）（n＝3）。隨著乙醇濃度的增加，綜合評分提高，70%乙醇提取時綜合評分達最高值，為（87.1±1.6）（n＝3）；90%乙醇提取時綜合評分為（86.8±2.1）（n＝3）?？紤]到用高濃度乙醇的成本較高，因此選用濃度為70%的乙醇作為提取溶媒。

2.4.3 乙醇用量的影響 分別用6、9、12、15、18倍體積的70%乙醇溶液進行提取，提取次數為2次，提取時間為1h，計算綜合評分。結果以6倍和9倍體積的乙醇提取時，綜合評分分別為（72.1±1.1）和（80.5±1.2）（n＝3）；12倍體積的乙醇提取時綜合評分達最高值，為（85.2±2.1）（n＝3）；15倍和18倍乙醇提取時，綜合評分分別為（84.8±1.9）和（84.6±1.8）（n＝3），與12倍乙醇提取幾乎相同?？紤]到大生產中乙醇用量的增加，會導致后續濃縮、干燥的工作量大幅增加，從而增加生產成本，故選擇9倍、12倍、15倍體積的乙醇用量進入正交試驗。

2.4.4 提取時間的影響 用12倍體積的70%乙醇分別提取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h，提取次數為2次，計算綜合評分。結果提取時間為0.5、1.0、1.5h時，綜合評分幾乎相同，分別為（82.1±2.0）、（79.8±1.8）和（81.6±1.7）（n＝3）。隨著提取時間延長，綜合評分增加。提取2.0和2.5h時，綜合評分達（86.4±1.9）和（85.8±1.7）（n＝3）?？紤]到總黃酮的提取率較高，在較短時間內已經溶出了大部分，并且隨著提取時間的延長，增加了無效物質的溶出，因此選擇0.5、1.0、1.5h三個提取時間進入正交試驗。

2.4.5 提取次數的影響 用12倍量的70%乙醇分別提取1、2、3、4次，每次提取時間為1h，計算綜合評分。結果發現，提取1次和2次時，綜合評分分別為（61.2±1.2）和（78.6±1.5）（n＝3）；提取3次時，綜合評分達最高值，為（89.6±2.2）（n＝3）；提取4次時，綜合評分為（88.5±1.7）（n＝3），與提取3次幾乎相同?？紤]到提取時間過長可能導致總黃酮的分解，故選擇提取1、2、3次三個水平進入正交試驗。

2.5 正交試驗 設計L9（34）正交試驗，見表1。分別精密稱取地錦草超微粉末10g，按正交設計安排實驗［4］，測定不同提取條件得到的總黃酮含量和浸膏得率，計算綜合評分，進行統計分析。正交試驗結果見表2和表3。由表2直觀分析可知，各因素對提取綜合評分的影響程度為：提取次數＞提取時間＞乙醇用量，最佳提取工藝為A2B2C3。經方差分析可見，提取次數對提取效果的影響有統計學意義（P＜0.05），而提取時間和乙醇用量的影響無統計學意義。故確定最佳提取工藝為A2B2C3，即地錦草超微粉末加12倍量的70%乙醇溶液回流提取2次，每次提取1.5h。

表1 正交試驗設計的因素和水平Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment design

表2 正交試驗設計和結果Table 2 Design and results of orthogonal test

表3 方差分析結果Table 3 Results of variance analysis

2.6 驗證實驗 稱取地錦草超微粉末50g，共3份，加12倍量70%乙醇溶液提取2次，每次1.5h。用70%乙醇補足減失重復，濾紙過濾，濾液用石油醚脫色后置2500ml量瓶中，用70%乙醇定容即得供試品溶液，按2.2項方法顯色后測定吸光度。結果測得藥材樣品中總黃酮含量為（6.53±0.04）mg／g，浸膏得率為（15.27±0.55）%（n＝3）。結果表明，檢測指標接近或高于正交表中最優值，表明優選的提取條件穩定、可行。

3 討 論

藥理學研究發現，地錦草有良好的抗菌、抗炎和止血作用，對游離羥基引發的DNA氧化損傷有一定的保護作用，并且可以清除和抑制自由基，是一種較強的抗氧化植物［5］。地錦草中含有黃酮類（槲皮素等）、沒食子酸、內消旋肌醇等活性化合物，其水提液和醇提液均具有較強的黃酮反應，因此本研究選擇總黃酮含量和浸膏得率作為提取效果的評價指標?？傸S酮的含量測定方法較多，常用方法有對照品測定法、金屬離子絡合法、HPLC法和熒光分光光度法等［6］。金屬離子絡合法的原理是基于黃酮類化合物分子中具有3－羥基、5－羥基或鄰二酚羥基，易與金屬鹽類如鋁鹽、鋯鹽、鍶鹽、鎂鹽等反應，生成有色的金屬絡合物。亞硝酸鈉－硝酸鋁－氫氧化鈉顯色反應由于測定結果穩定、可靠、重現性好，常用于黃酮類化合物的含量測定，本研究也選用該方法測定地錦草提取液中總黃酮的含量。

超聲提取主要是利用超聲波的空化作用加速植物有效成分的浸出，另外超聲波的次級效應，如機械振動、乳化、擴散、擊碎、化學效應等也能促進待提成分的擴散和釋放。與傳統回流提取法相比，雖然超聲提取的浸膏得率較低，但有效成分提取率高，提取時間短，省時、節能，操作方便，尤其對于熱敏感成分更為適宜，因此被廣泛用于植物有效成分的提取。超微粉碎是采用振動磨粉碎藥材，提高細胞破壁率，從而提高化學成分的溶出速率和溶出量；但由于超微粉末太細，加熱回流提取時要持續攪拌，否則容易糊化，給操作帶來困難。本研究將超微粉碎技術和超聲提取工藝相結合用于地錦草中總黃酮的提取，方法操作簡單、提取效率高、生產成本小，適宜在制劑生產中推廣應用。

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