瑞舒伐他汀對腦缺血再灌注損傷大鼠神經細胞凋亡及Caspase-3表達的影響

張俊華,蘇建華,陳玉芳,薛建琴,耿瑜睿

(1. 江蘇大學附屬金壇醫院(金壇市人民醫院)，江蘇 金壇 213200；2. 江蘇省常州市第四人民醫院，江蘇 常州 213000)

瑞舒伐他汀對腦缺血再灌注損傷大鼠神經細胞凋亡及Caspase-3表達的影響

張俊華1,蘇建華1,陳玉芳2,薛建琴1,耿瑜睿1

(1. 江蘇大學附屬金壇醫院(金壇市人民醫院)，江蘇 金壇 213200；2. 江蘇省常州市第四人民醫院，江蘇 常州 213000)

目的 觀察瑞舒伐他汀對大鼠腦缺血再灌注損傷神經細胞凋亡及Caspase-3表達的影響，探討其神經保護作用機制。方法 將健康雄性Wistar大鼠隨機分為假手術組、模型組、瑞舒伐他汀組，余假手術組外，其余2組制作缺血再灌注損傷大鼠模型。分別在腦缺血再灌注后12 h、24 h、72 h取各組大鼠腦組織，檢測神經細胞凋亡數及Caspase-3陽性表達細胞數。結果 與假手術組比較，模型組和瑞舒伐他汀組神經細胞凋亡數和Caspase-3陽性表達細胞數均明顯增加(P均<0.01)，瑞舒伐他汀組神經細胞凋亡數和Caspase-3陽性表達細胞數均明顯低于模型組(P均<0.01)；隨缺血再灌注時間延長，各組神經細胞凋亡數和Caspase-3陽性表達細胞數均逐漸減少，組內再灌注各時間點比較差異均有統計學意義(P均<0.01)。結論 瑞舒伐他汀對腦缺血再灌注損傷有神經保護作用，其作用機制可能與下調Caspase-3的表達、對抗細胞凋亡有關。

瑞舒伐他??；腦缺血再灌注損傷；神經細胞凋亡；Caspase-3

隨著現代醫學的不斷發展，證實凋亡和壞死共同導致腦缺血再灌注后的神經元死亡。缺血后神經元死亡分別涉及主動和被動細胞死亡機制，主要表現為壞死和凋亡2種形式。有研究表明，急性缺血性腦損傷后，在梗死的中心區細胞出現壞死，而在半暗帶區以凋亡為主，這種凋亡是梗死灶擴大的關鍵因素[1]。在腦缺血后程序性細胞死亡過程中激活了Caspase-3，Caspase-3直接參與了腦缺血再灌注損傷的病理生理過程，導致細胞骨架蛋白、DNA修復蛋白及其他Caspase相關底物蛋白的裂解，最終發生細胞凋亡[2]。本研究探討了瑞舒伐他汀對大鼠腦缺血再灌注損傷腦組織神經細胞凋亡及Caspase-3表達的影響,旨在為其臨床應用提供依據。

1 實驗資料

1.1實驗動物 健康雄性Wistar大鼠(SPF級)54只，體質量220～250 g，由東南大學動物中心提供，合格證號為SYXK(蘇)2010-0004。屏障環境普通顆粒飼料和自來水喂養，實驗室室溫維持在(21±2) ℃，濕度控制在50%～70%，每天更換墊料。

1.2 主要藥品和試劑 羊抗大鼠Caspase-3多克隆抗體,TUNEL凋亡試劑盒(武漢博士德公司),S-P免疫組化染色試劑盒,DAB顯色試劑盒(福州邁新公司)，其他試劑為國產分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組 54只Wistar成年大鼠在實驗室適應1周，按隨機化原則分為假手術組、模型組、瑞舒伐他汀組，每組18只。每組又按再灌注時間分為再灌注12 h、24 h和72 h 3個亞組,每組6只。

1.3.2 給藥方法 假手術組和模型組用0.9%氯化鈉20 mL/kg每天1次灌胃。瑞舒伐他汀組預先4周給予瑞舒伐他汀(南京正大天晴制藥有限公司國藥準字)4 mg/(kg·d)每天1次灌胃，再灌注期間繼續瑞舒伐他汀4 mg/(kg·d)每天1次灌胃。

1.3.3 大鼠腦缺血再灌注模型的建立 大鼠禁食24 h，采用腹腔內注射3%戊巴比妥1.6 mL/kg進行麻醉。取頸前左旁25 mm的縱向切口，鈍性游離左側頸總動脈(CCA)，結扎頸外動脈(ECA)和同側CCA近心端，用動脈夾夾閉頸內動脈(ICA)；在CCA結扎的遠心端剪一小口并插入A4號栓塞線，松開動脈夾，栓塞線進入左側頸內動脈，并延伸到大腦中動脈的起始部，然后用縫合線系住栓塞線，確認無活動性出血后縫合皮膚；在缺血3 h時將栓塞線拔出10 mm形成再灌注。假手術組手術步驟同手術組，但是術中不插入栓塞線。制作缺血再灌注損傷大鼠模型后，待每只大鼠麻醉清醒后，立即給予判定。實驗大鼠不能伸展對側前爪或者向對側轉圈或者向對側傾倒即為成功模型[3]。

1.3.4 大鼠腦組織標本取樣及制備 分別在腦缺血再灌注后12 h、24 h、72 h取大鼠腦組織。取樣方法：用3%戊巴比妥1.6 mL/kg對大鼠進行麻醉，開胸經左心室插管至主動脈并固定，剪開右心耳，先快速灌注100 mL冰生理鹽水，然后灌注400～600 mL 4 ℃的4%多聚甲醛磷酸緩沖液，直至肝臟、四肢發白和僵硬。斷頭取腦，取左側大腦頂葉皮質置于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中固定后用于細胞凋亡及免疫組化的檢測。

1.3.5 觀察指標和圖像分析 用TUNEL法檢測神經細胞凋亡情況；用免疫組織化學染色方法按S-P試劑盒說明書操作步驟檢測Caspase-3蛋白陽性表達細胞數。各組在各時間點分別進行神經細胞凋亡和Caspase-3蛋白表達檢測，每張切片400倍高倍鏡下任取5個視野分別計數相應的細胞凋亡數和Caspase-3陽性表達數，取其平均值。凋亡細胞呈棕褐色或棕黃色，顆粒深染，胞核固縮；Caspase-3陽性表達時胞質和/或核著色為棕黃色。

2 結 果

2.1神經細胞凋亡情況 見表1。

表1 各組神經細胞凋亡數比較個)

注：①與假手術組比較，P<0.01;②與模型組比較，P<0.01；③與再灌注12 h比較，P<0.01；④與再灌注24 h比較，P<0.01。

2.2 Caspase-3蛋白陽性表達情況 再灌注 12 h、24 h、72 h，模型組和瑞舒伐他汀組Caspase-3蛋白陽性數均明顯高于假手術組(P均<0.01)，瑞舒伐他汀組明顯低于模型組(P均<0.01);隨缺血再灌注時間延長,各組Caspase-3蛋白陽性數均逐漸減少，組內再灌注各時間點比較差異均有統計學意義(P均<0.01)。見表2及圖1～9。

表2 各組Caspase-3蛋白陽性表達細胞數比較個)

注：①與假手術組比較，P<0.01;②與模型組比較，P<0.01；③與再灌注12 h比較，P<0.01；④與再灌注24 h比較，P<0.01。

圖1 假手術組12 h Caspase-3陽性細胞表達情況(×400)

圖2 假手術組24 h Caspase-3陽性細胞表達情況(×400)

3 討 論

細胞凋亡與腦缺血再灌注損傷密切相關，在腦缺血再灌注損傷的病理生理過程中，細胞凋亡及多種基因表達的改變和互相調控起重要作用[4]，腦損傷范圍的大小與神經凋亡細胞的數量相關[5]。凋亡存在2種主要的相互關聯途徑，即內源性途徑(線粒體途徑)和外源性途徑(細胞表面死亡受體途徑)。目前已發現14種Caspase蛋白[6]，Caspase家族中的某些成員具有重要的調控和效應作用，參與了凋亡的信號傳導，Caspase-3作為其中一個重要成員，其表達和活化水平的異常升高則是啟動凋亡的關鍵環節[7]。正常狀態的腦細胞中，存在無活性的以休眠狀態的酶原形式存在的Caspase-3，以上2條途徑可將其激活。PARP、actin、fodrin、lamin等不同底物被活化的Caspase-3切割，從而導致蛋白酶級聯放大，最終使細胞走向凋亡[8]?；罨腃aspase-3通過水解特異性蛋白，一方面直接導致凋亡，另一方面破壞細胞骨架蛋白及其調節蛋白、參與DNA修復的酶等，抑制修復DNA，協助完成凋亡的過程。在腦組織缺血、損傷的凋亡過程中，可檢測到活性增強的Caspase-3蛋白因子[9]。

圖3 假手術組72 h Caspase-3陽性細胞表達情況(×400)

圖4 模型組12 h Caspase-3陽性細胞表達情況(×400)

圖5 模型組24 h Caspase-3陽性細胞表達情況(×400)

圖6 模型組72 h Caspase-3陽性細胞表達情況(×400)

圖7 瑞舒伐他汀組12 h Caspase-3陽性細胞表達情況(×400)

圖8 瑞舒伐他汀組24 h Caspase-3陽性細胞表達情況(×400)

圖9 瑞舒伐他汀組72 h Caspase-3陽性細胞表達情況(×400)

Caspase-3是細胞凋亡的關鍵蛋白酶，多種因素促使Caspase-3的激活和釋放，在凋亡過程中起著最后的樞紐作用。范磊等[10]研究報道，去除Caspase-3基因的大鼠和正常大鼠相比，腦缺血2 h再灌注48 h后，TUNEL陽性細胞數降低了36%，梗死體積下降了55%，這說明Caspase-3在腦缺血再灌注細胞損傷中發揮了重要作用。在腦組織缺氧缺血過程中及缺血再灌注損傷中，應用Caspase-3抑制劑可使腦缺血后神經元凋亡的數量明顯減少，腦缺血病灶范圍縮小，從而有效地保護腦細胞。以上研究結果說明Caspase-3參與了腦缺血性損傷，促進了神經元的凋亡，在神經元凋亡過程中發揮重要作用。

他汀類藥物是3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA) 還原酶抑制劑[11]，可能通過多種途徑、多種機制發揮抗氧化作用，從而挽救缺血半暗帶，保護缺血腦細胞[12]。本研究結果顯示，模型組和瑞舒伐他汀組缺血再灌注后神經細胞凋亡數及Caspase-3蛋白陽性表達數均明顯高于假手術組，再灌注12 h達高峰，然后逐漸下降。與模型組比較，瑞舒伐他汀組神經細胞凋亡數及Caspase-3蛋白陽性表達數明顯降低?？梢?，腦缺血再灌注損傷引起了神經細胞凋亡和Caspase-3陽性表達的增加，但是用瑞舒伐他汀預處理能減少神經細胞凋亡和Caspase-3的表達，從而減輕腦缺血再灌注損傷。

腦缺血再灌注后神經細胞凋亡是造成再灌注損傷的主要因素之一，改善腦缺血再灌注損傷的有效方法是阻斷再灌注后的神經細胞凋亡[13]。本研究發現，瑞舒伐他汀對腦缺血再灌注損傷有神經保護作用，其作用機制可能與下調Caspase-3表達、對抗細胞凋亡有關，本研究為臨床應用瑞舒伐他汀治療缺血性卒中提供了理論依據。

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Effects of Rosuvastatin on neural cell apoptosis and Caspase-3 expression of rats with cerebral ischemia reperfusion injury

ZHANG Junhua1, SU Jianhua1, CHEN Yufang2, XUE Jianqin1, GENG Yurui1

(1. Affiliated Jintan Hospital of Jiangsu University, Jintan 213200, Jiangsu, China; 2. The Forth People’s Hospital of Changzhou, Changzhou 213000, Jiangsu, China)

Objective It is to observe the influence of rosuvastatin on nerve cell apoptosis and Caspase-3 expression of rats with cerebral ischemia reperfusion injury, and investigate the mechanism of neuroprotection. Methods The healthy male Wistar rats were randomly divided into sham operation group, model group and rosuvastatin group, the ischemia reperfusion injury rat model were made in model group and rosuvastatin group respectively. The brain tissue of rats were obtain after cerebral ischemia-reperfusion in 12 h, 24 h, and 72 h, and then the number of the apoptosis of neural cells and Caspase-3 positive cells were measured. Results Compared with the sham operation group, the number of nerve cell apoptosis and Caspase-3 positive cells of the model group and rosuvastatin group were increased significantly (P<0.01). Compared with the model group, rosuvastatin significantly reduced the number of Caspase-3 positive cells, there is significant statistically significant difference (P<0.01). Conclusion Rosuvastatin on cerebral ischemia reperfusion injury has neuroprotective effect, and the mechanism may be associated with the down-regulation of Caspase-3 expression, against cell apoptosis.

Rosuvastatin; cerebral ischemia reperfusion injury; neuronal apoptosis; Caspase-3

張俊華，男，副主任醫師，主要從事神經內科臨床和科研工作。

蘇建華，E-mail:sjh2385225@163.com

金壇市科學技術局計劃項目(JT2013064)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.12.002

R-332

A

1008-8849(2015)12-1257-04

2014-12-02