天然油脂和表面活性劑對發酵性絲孢酵母產油脂及脂肪酶的影響

張 毅，孫 曉 璐，侯 英 敏，孫 玉 梅

（大連工業大學 生物工程學院，遼寧 大連 116034）

0 引 言

脂肪酶（EC 3.1.1.3）是一類能在油水界面上催化長鏈甘油酯水解和合成的羧酸酯酶［1］。在微生物合成油脂過程中，脂肪酶的可逆作用即脂質合成對生長、繁殖、積累養分有重要作用［2］。目前對于發酵過程中細胞內脂肪酶活力變化與油脂積累關系的報道很少，有研究表明酵母細胞內脂肪酶活力增加有利于細胞油脂積累［3］。

天然油脂中含有大量合成脂肪酸的中間物質，對微生物產油有促進作用［4］。大多數微生物只有在油類或者與油類相關物質存在時才能產生脂肪酶［5］。許多研究表明發酵培養基中添加一定量的油脂如花生油、豆油、橄欖油等可以不同程度地促進菌體產油和產酶［6－8］。表面活性劑可解除油脂存在使發酵系統供氧不足而抑制微生物生長和代謝，增加微生物和酶與油脂的接觸機會［9］，使微生物充分利用油脂進行發酵。陽離子型表面活性劑CTAB、非離子表面活性劑Tween 80 和陰離子表面活性劑SDS，可促進微生物生產油脂［10］。此外，表面活性劑對菌體產脂肪酶也有比較明顯的影響，一般來說，非離子表面活性劑有促進作用，陰離子表面活性劑主要起抑制作用［11］。

因此，研究油脂和表面活性劑對微生物產油脂的影響，對微生物合成油脂的代謝調節具有重要的意義。本文考察了天然油脂和表面活性劑對發酵性絲孢酵母產油脂及脂肪酶的影響，并初步探討酵母細胞內脂肪酶活力與油脂產量的關系。

1 材料與方法

1.1 菌 種

發酵性絲孢酵母（Trichosporonfermentans）：CICC1256，購自中國食品發酵工業研究院。

1.2 主要儀器、試劑

儀 器：JB－4A 磁力攪拌器、RZ－UVA2000－CC07組織搗碎機、LDZX－40數顯恒溫水浴鍋等。

試劑：大豆油，食用級；豬油，食用級；香河溢達油脂有限公司生產；Tween 80，分析純，石家莊海森化工有限公司生產；洗潔精，廣州奧奇麗有限公司生產；其余試劑均為分析純或生物試劑。

1.3 培養基

固體斜面培養基（g／L）：葡萄糖20.0，酵母粉10.0，蛋白胨10.0，瓊脂20%，pH 自然，于1.0×105Pa滅菌15min。

液體種子培養基（g／L）：葡萄糖100.0，蛋白胨5.3，酵母膏2.0，MgSO40.5，pH 自然，于0.8×105Pa 滅菌20 min，尿素2.0，于0.5×105Pa滅菌15min。

發酵培養基（g／L）：葡萄糖100.0，蛋白胨1.8，酵母膏0.5，KH2PO42.0，pH 自然，于0.8×105Pa滅菌20min。

1.4 實驗方法

1.4.1 培養方法

將4 ℃保存的酵母菌種接種于固體斜面上，在30 ℃下活化培養3d后轉接至液體種子培養基中，于30 ℃、160r／min搖床中培養，待種子長好后，接入發酵培養基，于30 ℃、160r／min搖床中進行發酵。

1.4.2 天然油脂對發酵的影響

在發酵培養基滅菌前加入不同濃度大豆油和體積分數為1.0%的豬油，發酵過程中定期取樣檢測細胞油脂含量和胞內脂肪酶活力。

1.4.3 表面活性劑對發酵的影響

在發酵培養基中滅菌前加入1.0%大豆油，并分別添加0.5%、1.0% Tween 80，0.5%、1.0%洗潔精，發酵過程中定期取樣檢測細胞油脂質量分數和胞內脂肪酶活力。

1.4.4 生物量測定

采用細胞干重法［12］。

1.4.5 細胞油脂質量分數測定

采用酸熱法［13］。

1.4.5.2 細胞油脂提取

采用乙醚－石油醚法［14］。用定量無水乙醇將破碎的細胞移入100mL具塞量筒中，加入15mL乙醚，充分混勻，靜置分層，用移液管吸取醚液層放入燒杯，在水浴上蒸出醚，得到油脂，于80℃干燥2h，冷卻后稱重。

w（油脂）＝油脂質量／干菌體質量×100%

1.4.6 粗酶液制備

在發酵過程中，定時取發酵液，于6 000r／min離心10min，收集菌體，稱取2g菌體與50mL磷酸緩沖溶液混合，在冰水浴中超聲破碎（破碎功率1 200 W，破碎時間30min，間隔時間10s），收集細胞破碎液，離心取上清液，即為粗酶液。

1.4.7 酶活力測定

臀肌攣縮癥在我國發病率比較高，但是其發病機制還不十分明確。常見原因是由于臀部注射了含有苯甲醇作為溶劑的青霉素形成臀部肌肉表面的攣縮帶所致［4］?；颊咄荒懿⑼认露?、不能蹺二郎腿，并且髖部常出現彈響。臀肌攣縮癥給廣大患者造成了很大的身心壓力。既往多采用切開松解攣縮帶的方法治療臀肌攣縮癥。但是手術的切口大，不美觀。近年由于關節鏡微創手術的逐步普及，我國劉玉杰教授等率先開始采用關節鏡進行關節外應用［5］。關節鏡微創手術治療臀肌攣縮癥就是關節鏡關節外應用的一大創舉［5～8］。

采用酸堿滴定法定量測定［14］。

脂肪酶活力定義：在測定條件下，每分鐘釋放1μmol脂肪酸所需的酶量為一個酶活力單位（U）。

2 結果與討論

2.1 天然油脂對發酵性絲孢酵母發酵產油脂及脂肪酶活力的影響

2.1.1 天然油脂對細胞油脂質量分數的影響

由圖1可知，在添加不同天然油脂的條件下，細胞油脂質量分數隨發酵時間延長而逐漸增大，發酵72h達到最大。發酵過程中以培養基中加入體積分數為1.0%大豆油時細胞油脂質量分數最大，最大值為30.7%；加入豬油時，細胞油脂質量分數最大值僅為21.6%。

2.1.2 天然油脂對胞內脂肪酶活力的影響

由圖2可知，各條件下的細胞內脂肪酶活力變化無明顯規律；整個發酵過程中幾乎均以加入體積分數為1.0%大豆油時脂肪酶活力最高，發酵60h達到峰值347.5U／mL；加入體積分數為1.0%豬油發酵72h 脂肪酶活力才有最大值247.5U／mL，比添加大豆油時脂肪酶活力低，達到最大脂肪酶活力所需時間長。

圖1 天然油脂對細胞油脂質量分數的影響Fig.1 Effects of natural oils on lipid content in cells

圖2 天然油脂對菌體脂肪酶活力的影響Fig.2 Effects of natural oils on intracellular lipase activity

實驗表明，添加適量大豆油更有利于細胞產油和產酶。這是因為大豆油中含有大量C12～C18等不同鏈長的脂肪酸［15］，其中部分脂肪酸組成與菌體油脂中脂肪酸組成有一定的相似性［16］，可被菌體吸收作為合成油脂的中間物，有利于細胞積累油脂［17］，但過多加入會影響溶解氧以至于影響菌體產脂和產酶［18］。豬油對細胞產油脂及產酶的提高效果不如大豆油。

2.2 表面活性劑對發酵性絲孢酵母產油脂及脂肪酶活力的影響

2.2.1 表面活性劑對細胞油脂質量分數的影響

由圖3可知，在添加不同表面活性劑的條件下，細胞油脂質量分數隨發酵時間延長呈上升趨勢，發酵72h達到最大。Tween 80 對細胞產油提升效果強于洗潔精。添加低濃度Tween 80對細胞產油有利，最適添加量為0.5%（體積分數），細胞最大油脂產量為30%；加入洗潔精時細胞最大油脂產量僅為14.3%。

圖3 表面活性劑對細胞油脂質量分數量的影響Fig.3 Effect of surfactant on lipid content in cells

2.2.2 表面活性劑對胞內脂肪酶活力的影響

由圖4可知，發酵培養基中加入Tween 80對細胞產酶促進效果比洗潔精好。加入低濃度表面活性劑可在較短時間內達最大產酶活力。Tween 80最適添加量為0.5%（體積分數），發酵24h脂肪酶活力即達最大值297U／mL。加入洗潔精后最高脂肪酶活力僅為148.5U／mL。

圖4 表面活性劑對菌體脂肪酶活力的影響Fig.4 Effect of surfactant on intracellular lipase activity

以上結果表明，培養基中應加入體積分數為0.5%的Tween 80 可促進細胞油脂積累和產胞內脂肪酶。這是由于Tween 80可使大豆油與發酵液能更均勻混合，可增強脂肪酶活力以及菌體發酵產油脂的正效應［9］；同時能增加細胞膜的通透性，有助于菌體對大豆油的吸收，使油脂積累效果更明顯［8，16］。低濃度表面活性劑有利于細胞較快積累油脂和產酶，可能高濃度表面活性劑對微生物代謝有一定的抑制作用。

2.3 酵母細胞脂肪酶活力與油脂產量關系的研究

通過對比圖1和圖2，加入體積分數為1.0%大豆油的培養基，細胞油脂產量與胞內脂肪酶活力均為最大；在發酵48～72h期間，脂肪酶活力提高最快，細胞油脂積累也最大，說明胞內脂肪酶活力增加對細胞積累油脂有促進作用。由圖3和圖4可得，培養基中加入Tween 80 時細胞中最大油脂產量和最高產酶活力均比加入洗潔精時高，表明細胞油脂含量與胞內脂肪酶活力呈現出一定正相關性。

3 結 論

（1）發酵培養基加入體積分數為1.0%的大豆油或0.5%的Tween80 對發酵性絲孢酵母產油和產酶有促進作用，最大油脂質量分數分別為30.7%，30%，最大脂肪酶活力分別為347.5，297U／mL。

（2）低濃度表面活性劑對菌體產油和脂肪酶更有利。

（3）發酵性絲孢酵母細胞中脂肪酶活力增加對細胞油脂積累有促進作用。

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