卡波氏肉瘤相關皰疹病毒ORF65抗體的制備及其特異性檢測＊

陳源紅，趙麗娟，梁有龍，張卓華，曾 怡△

（右江民族醫學院：1.微生物學與免疫學教研室；2.臨床本科2011級8班，廣西百色533000）

卡波氏肉瘤相關皰疹病毒（Kaposi′s sarcoma associated herpesvirus，KSHV）由Chang等［1］在1994年首先從AIDS相關型Kaposi′s肉瘤（Kaposi′s sarcoma，KS）患者的肉瘤組織發現，又稱 人 類8 型 皰 疹 病 毒（human herpesvirus-8，HHV-8）。KSHV 與原發性彌漫性淋巴瘤（primary effusion lymphoma，PEL）、多中心漿細胞增多癥（multicenter castleman′s disease，MCD）等惡性腫瘤發生密切相關［2］。此外，研究發現KSHV是卡波氏肉瘤發生的必需因素［3］。KS是一種少見的軟組織惡性多發性出血性血管肉瘤。臨床上分為4 型即經典型KS、AIDS相關型KS、非洲型KS及免疫抑制型KS［4］，因此，KS為艾滋病患者好發腫瘤之一。來源于體腔B 淋巴細胞瘤的BCBL-1細胞攜帶KSHV。KSHV 在宿主細胞內的復制周期分潛伏和裂解復制感染2個階段，其中，ORF65蛋白是病毒衣殼蛋白，在病毒裂解期表達并可誘導機體產生特異免疫應答，并且在KSHV 6 種衣殼蛋白中與其他皰疹病毒同源性最低［5-6］。因此，ORF65 蛋白是KSHV 病毒檢測及其疫苗研究制備的靶抗原，是目前KSHV 研究前沿熱點之一。為獲得高效價的ORF65蛋白抗體，本研究利用ORF65蛋白，通過免疫家兔制備特異性免疫血清，并對其效價及與KSHV 結合的特異性進行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 細胞 KSHV 潛伏感染的BCBL-1細胞（南京醫科大學盧春教授饋贈）。

1.2 動物 健康日本大耳白兔，雌性，體質量2.0～2.5kg，由右江民族醫學院實驗動物中心提供（批號：LX1304-A3）。

1.3 試劑與儀器 ORF65蛋白抗原肽［由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成］序列：ASDILTTLSSTTETAAPAVADARKPPSGKKK。細胞培養基RPMI-1640 為Bio Whittaker Cambrex Company產品，胎牛血清為Gibco 公司產品，山羊抗兔IgG（H＋L）-HRP、IgG（H＋L）-Alexa fluor 488、發光蛋白購自Cell Signaling Technology，完全弗氏佐劑及不完全弗氏佐劑、OPD 底物、HRP-DAB底物顯色試劑盒購于天根試劑公司，細胞免疫染色固定液、抗熒光淬滅封片液、Western細胞裂解液、超敏ECL化學發光試劑盒為碧云天產品，預染蛋白分子量標準為Ferments公司產品，其他試劑均為國產分析純產品。倒置相差顯微鏡（Leccia Microsystems CMS GmbH），酶聯免疫檢測儀（Berthold LB941），電熱恒溫水浴箱WH.W21.CU600（上海醫療器械七廠），激光共聚焦顯微鏡（FV-500奧林巴斯），ChemidocXRS型凝膠成像系統為美國Bio-Rad產品。

1.4 方法

1.4.1 家兔多克隆抗體的制備 選擇4只純種健康日本大耳白家兔，實驗前采集家兔血清，作為陰性對照，分別用合成的ORF65蛋白抗原肽進行0、2、4、6周免疫程序皮內、皮下多點注射免疫。初次免疫抗原肽與完全弗氏佐劑等量混合，再次免疫抗原肽與不完全弗氏佐劑等量混合、充分乳化，免疫劑量為每只2mg。同時，于第4次免疫后1周，取心臟血。收集的血液于4 ℃下靜置過夜，4 ℃下3 000r／min離心5min，取血清分裝，置于-20 ℃冰箱保存備用。

1.4.2 家兔血清中抗ORF65抗體的ELISA 檢測 用方陣滴定法確定包被抗原和血清的最適工作濃度，將包被抗原（ORF65）用pH9.6 的碳酸鹽 緩 沖液稀釋 為1.25、2.5、5.0、10.0μg／mL的溶液，取免疫血清及陰性血清各1 份，作1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800稀釋，ELISA 間接法檢測血清抗體效價［7］。測定450 nm 處抗體稀釋度均值（A 值），將450nm 處A 值為1.0左右的抗原包被濃度和血清稀釋度確定為抗原肽的最適包被濃度和血清最佳稀釋度［8］。

1.4.3 家兔免疫血清中抗ORF65抗體的間接免疫熒光檢測 調整BCBL-1細胞濃度至1×106個／mL，用無血清培養基同步化24h后，加含20ng／mL佛波酯（TPA）的完全培養基培養48h。收集細胞，調整細胞濃度至2×106個／mL，離心涂片，用免疫染色固定液固定。0.1% PBS-T 洗滌3 次；用5%的BSA 37 ℃封閉30min，洗滌3次；分別加家兔ORF65免疫血清、免疫前兔血清，37 ℃孵育30 min，洗滌3 次；加山羊抗兔IgG（H＋L）-Alexa fluor 488，洗滌3次；PI染料染色5min，洗滌3次；用抗熒光淬滅封片液封片，鏡檢。

1.4.4 家兔免疫血清中抗ORF65抗體的Western blot檢測 用20ng／mL TPA 誘導BCBL-1細胞48h，使細胞中KSHV活化，同時以未加TPA 刺激的BCBL-1細胞為對照。收集各組BCBL-1細胞蛋白加入RIPA（強級）裂解液，4 ℃下16 000 r／min離心5min。取上清液，電泳考馬斯亮藍染色確定上樣量，分裝，-80 ℃保存。進行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離蛋白。轉膜后，室溫下用5%脫脂奶粉封閉1h，1×TBST 緩沖液漂洗3次；分別加免疫血清及β-Actin一抗，4 ℃下孵育過夜，洗膜3次；加辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗孵育1h，洗膜3次；加化學發光試劑，于凝膠成像儀（chemidoc XRS，Bio-Rad，USA）中成像。

1.5 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，兩樣本均數間采用t檢驗分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 抗原和免疫血清的最適工作濃度 根據ELISA 方陣滴定法檢測的要求，選擇A 值在1.0左右時的抗原抗體濃度為最佳工作濃度，結果見表1、2。在接近A450＝1的組合中，得出最佳的工作濃度：抗原包被濃度為2.5 mg／L、抗體濃度為1∶6 400的組合。從抗原抗體最佳工作濃度的間接ELISA 法結果顯示，在抗體濃度為1∶12 800，抗ORF65免疫血清抗血清A 值為（0.656±0.024），陰性血清A 值為（0.075±0.023），差異有統計學意義（P＜0.01），說明血效價達1∶12 800以上，已成功制備ORF65的多克隆抗體。

表1 抗ORF65免疫血清最適工作濃度方陣滴定（±s）

表1 抗ORF65免疫血清最適工作濃度方陣滴定（±s）

＊：P＜0.01，與陰性對照組比較。

ORF65（μg／mL）A值陰性對照1∶100 1∶100 1∶200 1∶400 1∶800 1.25 1.233±0.036＊ 0.960±0.056＊ 0.888±0.025＊ 0.885±0.034＊0.293±0.031 2.5 1.376±0.023＊ 1.335±0.045＊ 1.282±0.041＊ 1.231±0.021＊ 0.282±0.021 5.0 1.223±0.033＊ 1.138±0.032＊ 0.933±0.047＊ 0.823±0.044＊ 0.369±0.038 10.0 0.908±0.039＊ 0.884±0.027＊ 0.812±0.033＊ 0.739±0.025＊0.291±0.046

表2 抗ORF65免疫血清最適工作濃度方陣滴定（±s）

表2 抗ORF65免疫血清最適工作濃度方陣滴定（±s）

＊：P＜0.05，△：P＜0.01，與陰性對照組比較。

ORF65（μg／mL）A值陰性對照1∶100 1∶100 1∶200 1∶400 1∶800 1.25 0.804±0.038△ 0.633±0.023△ 0.445±0.020＊0.364±0.019 0.293±0.031 2.5 1.182±0.042△ 1.085±0.028△ 0.998±0.033△ 0.656±0.024△ 0.282±0.021 5.0 0.761±0.025△ 0.604±0.027△ 0.318±0.026 0.218±0.029 0.369±0.038 10.0 0.609±0.024△ 0.325±0.033 0.267±0.035 0.184±0.039 0.291±0.046

2.2 免疫熒光法檢測ORF65蛋白表達及定位 陰性對照組顯示微弱的綠色熒光，而實驗組則顯示較強的綠色熒光，且綠色熒光較多地集中在細胞質上，這說明ORF65 蛋白表達于BCBL-1細胞，并且表達于細胞質上，見圖1。

圖1 間接免疫熒光檢測免疫血清對BCBL-1細胞中ORF65蛋白的免疫反應性（×400）

2.3 蛋白質免疫印跡法檢測ORF65 蛋白表達 TPA 誘導BCBL-1細胞組及未加TPA 刺激的BCBL-1細胞對照組在21 kD 處均有特異性蛋白條帶，其大小與ORF65蛋白大小相符，且TPA 誘導BCBL-1細胞組蛋白表達量明顯高于未加TPA刺激的BCBL-1細胞對照組組，見圖2。

圖2 抗ORF65抗體特異性的Western blot鑒定

3 討 論

KSHV 是卡波氏肉瘤發生的必需因素，跟未發生KS 的KSHV 感染者比較，KS 患者體內KSHV 的病毒載量含量較高，體內含活化病毒的細胞數量與組織發生惡化及病毒感染的進程有相應關系；而且在疾病的發展進程中病毒載量也隨之提高［9-10］。KSHV 處于潛伏感染狀態下的被重激活并裂解復制，此時可檢測到多種病毒裂解復制產物，復制相關基因ORF59、包裝相關基因ORF29、主要衣殼蛋白ORF26、包膜糖蛋白K8.1、小衣殼蛋白ORF65蛋白等，同時，KSHV 包裝產生新的感染性病毒顆粒［11-15］。其中，ORF65蛋白是在子代病毒的裝配中有重要作用，ORF65蛋白在細胞內主要發揮轉運其他衣殼蛋白的功能，一旦ORF65蛋白缺失，病毒會發生衣殼缺失。因此，ORF65蛋白可作為檢測KSHV 感染的一個重要的免疫學指標，也可以作為一個新的抗病毒靶點。

抗原抗體反應具有比例性，如果抗原抗體的濃度和比例適合則形成的復合物體體積大、數量多。如包被抗原濃度過高，由于蛋白質與酶標板的聚苯乙烯分子間的相互作用，蛋白質容易吸附于酶標板表面，可能產生前帶現象而降低敏感性。如果包被液中的抗原濃度過低，固相載體（酶標板）表面不能被完全覆蓋，酶標板孔表面容易非特異性吸附相繼加入的一抗血清標本和二抗中的蛋白質，產生非特異性顯色而影響檢測結果，因此，在ELISA 方陣滴定法中接近A450＝1的組合中，得出最佳的抗原抗體工作濃度［7］。另外，在抗ORF65免疫血清濃度為1：12 800，抗血清A 值為0.656±0.024，陰性清A 值為0.075±0.023，差異有統計學意義（P＜0.01）。在進一步的免疫熒光檢測實驗中，用免疫血清可以檢測到TPA 誘導活化的KSHV 感染的BCBL-1細胞顯示較強的綠色熒光；用Western blot則可以檢測到TPA 刺激與未刺激的BCBL-1 細胞中，TPA 刺激的BCBL-1細胞中病毒衣殼蛋白ORF65的表達量較高，該抗血清具有特異性。因此，推斷本研究獲得了高效價的抗ORF65家兔免疫血清。

本研究成功制備KSHV ORF65多克隆抗體，該結果為進一步制備ORF65單克隆抗體奠定了基礎?；贠RF65蛋白在KSHV 復制中的重要作用，成功制備該抗體也為進一步研究臨床KSHV 感染檢測方法和探索抗病毒新靶點的研究奠定基礎。

［1］ Chang Y，Cesarman E，Pessin M，et al.Identification of herpesvirus like DNA sequences in AIDS-associated K aposics sarcoma［J］.Science，1994，266（5192）：1865-1869.

［2］ Katano H，Sata T.Human herpesvirus 8virology，epidemiology and related diseases［J］.Jpn J Infect Dis，2000，53（4）：137-155.

［3］ Dilnur P，Katano H，Wang ZH，et al.Classic type of kaposi′s sarcoma and human herpesvirus 8infection in Xinjiang，China［J］.Pathol Int，2001，51（11）：845-852.

［4］ 馬春雷，普雄明，吳衛東.新疆Kaposi肉瘤患者感染的人類皰疹病毒8型ORF75 基因多態性研究［J］.實用皮膚病學雜志，2009，26（2）：68-71.

［5］ Fu B，Li BL，Wang LD.Immunogenicity analysis of prokaryotic expression products of Kaposi′s sarcoma associated herpesvirus ORF65［J］.Virologica Sincia，2008，23（3）：196-202.

［6］ 王娜，冷弘，燕備戰，等.人類皰疹病毒8抗原融合的構建及初步應用［J］.重慶醫學，2013，42（23）：2703-2705.

［7］ 楊婷婷，孫秀蘭，邵景東，等.百草枯人工抗原的合成及抗體的制備［J］.細胞與分子免疫學雜志，2008，24（9）：924-927.

［8］ 杜瑞雪，范仲學，郭篤發.PCB77人工抗原的合成及多克隆抗體的制備［J］.細胞與分子免疫學雜志，2010，26（2）：149-151.

［9］ Ballestas ME，Chatis PA，Kaye KM.Efficient persistence of extrachromosomal KSHV DNA mediated by latencyassociated nuclear antigen［J］.Science，1999，284（5414）：641-644.

［10］ Decker LL，Shankar P，Khan G，et al.The kaposi sarcoma-associated herpesvirus（KSHV）is present as an intact latent genome in KS tissue but replicates in the peripheral blood mononuclear cells of KS patients［J］.J Exp Med，1996，184（1）：283-288.

［11］ Sun R，Lin SF，Gradoville L，et al.A viral gene that activates lytic cycle expression of Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95（18）：10866-10871.

［12］ Sarid R，Flore O，Bohenzky RA，et al.Transcription mapping of the Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus（human herpesvirus 8）genome in a body cavity-based lymphoma cell line（BC-1）［J］.J Virol，1998，72（2）：1005-1012.

［13］ 南玉龍，譚曉華，楊磊.KSHV 潛伏和裂解感染機制的研究進展［J］.中國醫學創新，2012，9（3）：151-153.

［14］ Lan K，Kuppers DA，Verma SC，et al.Induction of Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus latency-associated nuclear antigen by the lytic transactivator RTA：a novel mechanism for establishment of latency［J］.J Virol，2005，79（12）：7453-7465.

［15］ 程偉，郝婷婷，王子盾，等.HSV-1作用于KSHV ORF50啟動子區中特異性應答位點序列的初尋［J］.南京醫科大學學報：自然科學版，2011，31（5）：595-600.