miR—30d通過抑制自噬影響喉癌細胞的增殖和耐藥性

湯俊照

摘要：研究miR-30d抑制喉癌細胞株人喉癌表皮細胞（Hep-2）的發展和耐藥性的作用機制。方法收取手術后的患者樣本，液氮法保存新鮮喉癌組織和正常喉組織，實時定量熒光PCR法檢測喉癌組織和正常組織中miR-30d的表達量。在Hep-2細胞系中采用脂質體轉染的方法轉染miR-30d寡聚核苷酸、miR-NC無義序列以及BECN1質粒，生物信息學方法預測miR-30d潛在靶點，雙熒光素酶報告基因法驗證miR-30d的靶點，Western blot技術檢測蛋白表達量，CCK-8法檢測細胞增殖，流式細胞術檢測細胞凋亡。結果喉癌組織組織與正常組織相比miR-30d表達量明顯降低，并隨著世界衛生組織規定（WHO）的臨床分期級數增加而更加明顯。轉染miR-30d寡聚核苷酸序列后，miR-30d表達量較對照組明顯上調，并且轉染miR-30d后能明顯抑制人喉癌細胞的增殖、自噬水平和耐藥性。生物信息學預測發現BECN1是miR-30d的潛在靶點，并且雙熒光素酶報告基因和Western blot進一步驗證了BECN1是其靶點。此外，過表達BECN1能夠逆轉miR-30d對Hep-2增殖、自噬水平和耐藥性的抑制作用。結論在喉癌組織中miR30d量表達明顯下調；miR-30d能夠抑制喉癌細胞Hep-2的增殖、自噬水平和耐藥性；BECN1是miR-30d的靶基因；過表達BECN1能逆轉miR-30d對喉癌細胞的影響；miR-30d是潛在的人喉癌細胞早期診斷和基因治療的候選靶點。

關鍵詞：MiR-30d；喉癌；自噬；BECN1

喉癌（LSCC）是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，目前治療喉癌的方式主要是手術和放療，雖然近20年來喉癌的臨床診斷和手術技術有了很大改進，但是由于喉癌臨床用藥的耐藥性致使喉癌預后仍不甚理想[1-3]。MicroRNA（miR）是一種長度為18～25nt的單鏈非編碼小分子RNA，miR的異常表達影響癌基因或者抑癌基因的表達從而影響腫瘤發生、發展和耐藥等過程[4， 5]。自噬是細胞中普遍存在的生理機制，自噬在腫瘤發生、發展和腫瘤的耐藥過程中起著重要的作用，目前許多研究表明miR能調節腫瘤自噬的水平來調節腫瘤的發生發展[6， 7]。BECN1 是形成自噬體的一個必需分子，它通過介導其它自噬蛋白定位于吞噬泡，來調控哺乳動物自噬體的形成與成熟，并且其通過調節自噬活性來影響腫瘤[8-10]。miR-30d在多種腫瘤里呈低表達并表現為抑癌作用[11]，本研究探討miR-30d對喉癌細胞株人喉癌表皮細胞（Hep-2）細胞增殖、自噬水平和耐藥性的影響，并發掘其作用靶點，探究miR-30d抑制喉癌的分子機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 人喉癌細胞系Hep-2來源于美國ATCC細胞庫。DMEM培養基購自Hyclone公司。胎牛血清（FBS）購自Clark公司。OPTI-MEM無血清培養基、胰酶和EDTA購自Gbico。miR-NC mimics、miR-30d mimics購自銳博生物有限公司。BECN1質粒購自addgene公司。轉染試劑Lipofectamine 2000、Annexin V FITC凋亡檢測試劑盒和TRIzol購自Invitrogen公司。CCK-8檢測試劑盒購自日本同仁化學研究所。5-氟尿嘧啶（ 5-fluorouracil，5-FU）購自sigma公司。M-MLV逆轉錄試劑盒、SYBR Premix Dimer EraserTM和Taq DNA 聚合酶購自TakaRa公司。TransStartFastPfu DNA Polymerase試劑盒購自北京全式金公司。膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒購自Axygen公司。Dual-Luciferase Reporter Assay 試劑盒購自Promega公司。RIPA細胞裂解液和BCA蛋白檢測試劑盒購自碧云天公司。PVDF膜購自whatman公司。ECL化學發光試劑購自Pierce公司。BECN1抗體和LC3抗體購自Sigma公司。GAPDH抗體購自Bioworld公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養與轉染 細胞按照推薦的培養方法，將細胞接種到六孔板。轉染前細胞內加無血清細胞培養液，將所要轉染的mimics或者質粒加入OPTI-MEM中輕輕混勻，同時將Lipofectamine 2000加入另一管OPTI-MEM中輕輕混勻，靜置5min后，將上述兩種溶液混合，室溫孵育30min后吸去六孔板中的培養液，將上述混合液加入培養皿，隨后輕輕混勻，細胞培養箱內培養3～6h后，吸除培養液，加入新鮮細胞培養液繼續培養。

1.2.2 細胞增殖檢測 將轉染的Hep-2細胞消化，將細胞傳代至96孔板，每隔24h檢測細胞活性。用PBS十倍稀釋CCK-8溶液，吸盡培養板中培養基，每孔加入1混勻的CCK-8稀釋液。另取一孔加入CCK-8稀釋液作為空白對照。將培養板放于培養箱內孵育1h后用酶標儀測定吸光度讀值，波長設為450nm。

1.2.3 Real-time PCR 方法檢測 Hep-2轉染48h后加入足夠的冷的PBS于在培養皿中，充分洗滌細胞，棄去PBS，重復以上操作2～3次。Trizol法提取RNA，測定濃度進行定量反轉成cDNA。采用SYBR法進行Real-time PCR檢測，采用2-△△Ct法分析實驗結果。

1.2.4流式細胞儀檢測細胞凋亡 細胞轉染24h加入20μg /ml 5-氟尿嘧啶處理48h后消化并經PBS洗后收集細胞，1500r/min 離心5min，加入凋亡染料后送流式細胞檢測。

1.2.5Western blot檢測 細胞轉染后48h將細胞消化后加入裂解液裂解，BCA法測定蛋白濃度制備1μg /ml的蛋白樣品，20μl上樣于質量分數為10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，濕轉于甲醇活化的聚偏二氟乙烯（PVDF）并用5%的脫脂奶粉室溫封閉2～3h，一抗4℃過夜，PBST洗滌3次后二抗孵育2～3h，PBST洗滌三次后使用ECL顯影，凝膠成像儀成像。

1.2.6熒光素酶報告基因質粒的構建和檢測 設計熒光素酶報告基因質粒的引物為，用高保真酶FastPfu DNA Polymerase 進行PCR，PCR產物經膠回收、酶切、連接后轉化進行菌落

鑒定和質粒提取，最后測序進行驗證后得到目的質粒。將Hep-2細胞接種至24孔板，每孔8×104個細胞，將miR-30d mimics、miR-NC mimics、報告基因質粒和PGL4.74質粒轉染至細胞內，24h后使用Dual-Luciferase Reporter Assay 試劑盒分析檢測。

1.2.7統計學分析 數據經過至少3次獨立實驗取平均值進行分析，并進行t檢驗，采用方差分析，P<0.05為顯著性差異。

2 結果

2.1 miR-30d在喉癌組織中低表達 使用實時熒光定量PCR法對38例喉癌組織和19例正常喉組織中miR-30d的表達量進行檢測，發現與正常喉組織相比喉癌組織中miR-30d表達量明顯下調（圖1 A， P<0.05）。并且按照WHO臨床分級標準對喉癌組織進行分級，發現隨著臨床分級水平提高miR-30d表達量下調越明顯（圖1 B， P<0.05）。

2.2miR-30d抑制喉癌細胞的增殖和自噬水平 將喉癌細胞株Hep-2脂質體轉染的方式轉染miR-30d mimics和miR-NC mimics，實時熒光定量PCR法檢測轉染效率，發現miR-30d表達量明顯上調（圖2 A， P<0.05）。將轉染后的細胞消化接種至96孔板通過CCK-8檢測增殖能力，發現miR-30d轉染后明顯抑制喉癌細胞的增殖能力（圖2B， P<0.05）。同時對轉染的細胞進行加5-Fu處理，流式細胞術檢測發現miR-30d能夠促進細胞凋亡從而增加喉癌細胞的化療敏感性（圖2 C， P<0.05）。并且通過Western Blot法檢測發現miR-30d能抑制喉癌細胞的自噬水平，這提示miR-30d對喉癌細胞的抑制作用是通過其抑制其自噬水平來發揮作用的（圖2 D）。

2.3miR-30d靶向抑制自噬相關蛋白BECN1的表達 通過生物信息學網站TatgetScan網站預測miR-30d能夠靶向BECN13'UTR區域（圖3 A），并且通過熒光素酶報告基因法驗證miR-30d能夠靶向抑制BECN1表達（圖3 B，P<0.05）。同時Western Blot結果也表明在喉癌細胞系Hep-2中過表達miR-30d可明顯下調BECN1的表達量（圖3 C）。

2.4過表達BECN1能夠逆轉miR-30d對喉癌細胞的抑制作用 在喉癌細胞系中分別轉染miR-30d mimics，miR-NC mimics，miR-30d mimics+BECN1，通過Western Blot進行檢測，發現喉癌細胞中過表達BECN1能逆轉miR-30d對BECN1靶向抑制作用并且能夠逆轉miR-30d對喉癌細胞自噬的抑制作用（圖4 A）。同時將上述轉染的細胞分別用CCK-8法檢測細胞增殖以及用流式細胞法檢測藥物敏感性，發現過表達BECN1均能顯著逆轉miR-30d對喉癌細胞的抑制作用（圖4 B、C，P<0.05）。

3 討論

喉癌是喉部最常見的惡性腫瘤之一，在我國呈現一定區域性，臨床治療方法主要以手術為主化療為輔，目前五年生存率仍然很低，需要發展更有效的治療方案[12]。喉癌發病機制本質上是多基因異常表達，通過原癌基因的過表達，喉癌細胞異常增生和侵襲，并且對化療藥物產生耐藥性[13， 14]。miR是近年來腫瘤研究領域較為熱門的非編碼RNA，它常通過靶向癌基因或者抑癌基因來調節癌細胞的發生發展，目前眾多研究表明腫瘤的發生、發展與miR的異常表達有很大關聯[15]。

自噬是細胞一種自我保護的機制，在腫瘤發生初期，自噬常表現為抑制腫瘤產生的作用，而當腫瘤形成后，腫瘤細胞中的自噬則表現為對其的保護作用，幫助腫瘤細胞抵御外界不良因素，表現為促進腫瘤增殖、增加藥物耐受性等[16-18]。目前已有許多研究表明miR能通過調節腫瘤細胞的自噬水平來調控腫瘤細胞的發生、發展。腫瘤細胞中miR的異常表達導致腫瘤細胞自噬水平的紊亂，從而調控腫瘤的生物學功能[19-21]。

本研究發現miR-30d在喉癌組織中明顯下調并且能通過靶向抑制自噬相關蛋白BECN1的表達來調節喉癌細胞的自噬水平從而抑制喉癌細胞的增殖和藥物耐受性，過表達BECN1能夠逆轉這一過程。本研究部分揭示了miR-30d抑制喉癌細胞的部分機制，這為miR-30d成為臨床早期診斷標記和研發治療喉癌的分子靶向藥物提供較好的提示作用。然而喉癌細胞的發生、發展機制是一個較為復雜的網絡調控過程，未來仍然有許多問題需要我們去探討。

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