EPHA2在人骨髓間充質干細胞成骨分化中的作用*

孫 博， 張 弢， 楊 龍， 李 靖， 任厚相， 孫 琦， 王建吉， 葉 川*

(1．貴陽醫學院， 貴州 貴陽 550004；2．中國人民解放軍第117醫院 骨科， 浙江 杭州 311201)

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·特約專論·

EPHA2在人骨髓間充質干細胞成骨分化中的作用*

孫 博1**， 張 弢2， 楊 龍1， 李 靖1， 任厚相1， 孫 琦1， 王建吉1， 葉 川1***

(1．貴陽醫學院， 貴州 貴陽 550004；2．中國人民解放軍第117醫院 骨科， 浙江 杭州 311201)

目的： 研究EPHA2在人骨髓間充質干細胞(hBMSC)成骨分化過程中表達的動態變化及其在成骨分化中的作用。方法： hBMSC成骨分化誘導0、4、10和14 d后分別收集細胞提取RNA和蛋白， 采用Real-time PCR和Western blot方法檢測EPHA2 mRNA及蛋白表達；使用EPHA2的si-RNA下調EPHA2表達后進行成骨分化誘導，檢測下調EPHA2表達對早期成骨分化指標ALP活性及晚期成骨分化指標鈣沉積、成骨分化標志物OSX 、OCN和成骨分化關鍵轉錄因子RUNX2表達的影響。結果： EPHA2在hBMSC成骨分化過程中表達逐漸上升，下調EPHA2表達能抑制ALP活性和鈣沉積，抑制OSX、OCN及關鍵轉錄因子RUNX2的表達。結論： EPHA2在hBMSC成骨分化過程中表達逐漸上升，EPHA2可能通過增強RUNX2的表達從而促進hBMSC成骨分化。

EPHA2；人骨髓間充質干細胞；成骨分化；RUNX2

人骨髓間充質干細胞(human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSC)來源于發育早期的中胚層，是一種具有自我更新能力和多向分化潛能的成體干細胞[1]。由于hBMSC獲取容易、易于體外培養和連續傳代，冷凍保存后仍具有多向分化潛能，使其成為理想的種子細胞廣泛用于再生醫學研究[2]。骨缺損是臨床上常見的骨骼系統疾病，嚴重危害患者的生活質量，以間充質干細胞為細胞源的骨再生工程為這些患者帶來了新的希望。BMSC成骨分化受多種信號通路調控，最近的研究發現，ephrin-Eph信號通路在成骨分化中發揮著重要的作用[3]。在小鼠BMSC成骨分化過程中，ephrin-Eph信號通路配體ephrinA5/B1/B2和受體EPHA2/B2/B4/B6表達顯著上升[4]，該通路其它配體和受體在成骨分化特別是hBMSC成骨分化中的作用尚不清楚[5]。EPHA2是一個分子量為130 kDa的跨膜糖蛋白，能夠通過AKT、FAK、MAPK等多條信號通路促進多種腫瘤的惡性進展[6]。研究發現EPHA2在小鼠成骨細胞中表達，且在小鼠BMSC成骨分化過程中表達上升，提示其在成骨分化中可能發揮重要的作用[7]?；诖?，本研究以hBMSC為模型，研究EPHA2在hBMSC成骨分化中表達的動態變化及其在成骨分化中的作用。

1 材料方法

1.1 材料

α-MEM培養基購自Gibco公司，胎牛血清為杭州四季青公司產品，si-EPHA2、Lipofectamine 2000轉染試劑和RNA提取試劑TRIzol購自Invitrogen公司，SYBR Premix ExTaq M定量PCR試劑為大連寶生物公司產品，EPHA2、RUNX2、OSX和OCN抗體購自CST公司，Tubulin抗體購自Santa Cruz公司，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)檢測試劑盒購自南京建成生物研究所，茜素紅S (Alizrin Red S)為Sigma公司產品。

1.2 人骨髓間充質干細胞的分離、培養和成骨誘導

經倫理委員會批準和本人簽署知情同意書，hBMSC取自一位32歲健康男性志愿者，采用密度梯度離心法獲取hBMSC，在加有雙抗的含10%胎牛血清的α-MEM培養基中培養。本實驗使用的hBMSC均為第4代。成骨分化誘導時，將hBMSC接種至6孔板中，待細胞密度長至60%左右時加入成骨誘導分化液(10%胎牛血清的α-MEM培養基中加入10 mmol/L β-磷酸甘油鈉、50 mg/L維生素C和0.1 μmol/L地塞米松)，3 d換液1次。

1.3 Real-time PCR

在成骨分化的第0、4、10和14 天收集細胞，按TRIzol試劑盒說明書提取細胞RNA，反轉錄后進行Real-time PCR。Real-time PCR按照SYBR Premix Ex Taq試劑盒說明書進行，反應體系如下：SYBR Premix Ex Taq 10 μL、cDNA 1 μL、上游引物 1 μL、下游引物 1 μL，加H2O 7 μL補至20 μL，反應在Applied Biosystems公司的7900HT Fast Real-time PCR system上進行，每一樣品均設3個重復孔，以GAPDH作為內參。EPHA2引物序列：Forward GGGACCTGATGCAGAACATC, Reverse AGTTGGTGCGGAGCCAGT。RUNX2引物序列：Forward TCTTAGAACAAATTCTGCCCTTT, Reverse TGCTTT

GGTCTTGAAATCACA。OSX引物序列：Forward CCTCCTCAGCTCACCTTCTC，Reverse GTTGGGAGCCCAAATAGAAA。OCN引物序列：Forward AGCAAAGGTGCAGCCTTTGT，Reverse GCGCCTGGGTCTCTTCACT。GAPDH引物序列：Forward GAAGGTGAAGGTCGGAGTC，Reverse GAGATGGTGATGGGATTTC。

1.4 Western blot 分析

在成骨分化的第0、4、10和14 天收集細胞，提取蛋白，蛋白定量后加入5×SDS沸水浴5 min，進行SDS-PAGE 電泳、轉膜，然后使用5%的脫脂奶粉進行封閉，1 h后加入相應一抗4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜3 次后加入辣根過氧化物酶偶聯的二抗，孵育2 h后用TBST 洗膜3 次，加入ECL發光劑顯色3 min后壓片顯影。

1.5 siRNA轉染

轉染前1天接種細胞，使第2天細胞密度達到50%左右為宜。轉染前1 h更換不含血清和抗生素的培養基，轉染時將稀釋的Lipofectamine 2000和siRNA(50 nmol/L)充分混勻室溫靜置20 min后加入培養皿中，培養12 h后更換正常培養基，24 h后進行成骨誘導分化。

1.6 ALP活性檢測

hBMSC成骨分化第4天，吸除培養板中的培養液，PBS洗2遍后，按ALP試劑盒說明書進行ALP活性檢測，用酶標儀測出各孔吸光度值，同時采用BCA法檢測細胞內總的蛋白量，用以校正ALP活性。每組樣品重復3次。

1.7 鈣鹽沉積實驗

hBMSC成骨分化第14天，棄去培養基后使用PBS洗2遍，戊二醛固定后使用ddH20清洗3次后加入0.4%茜素紅S，光鏡下觀察，待出現紅色物質堆積時后棄去染液，使用ddH20終止反應和洗滌，顯微鏡下拍照。為了定量檢測鈣鹽沉積，染色后加入冰乙酸在搖床上孵育30 min，刮下后于85℃水浴10 min，冰上5 min，高速離心后15 min，取400 加入10%NH4OH，將pH調到4.5后，用酶標儀于405 nm處測吸光度值，每組樣品重復3次。

1.8 統計學分析

所有數據均使用SPSS統計軟件進行統計學分析，數據以均值±標準差表示，組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 EPHA2在hBMSC成骨分化過程中的表達

Real-time PCR及Western blot檢測結果顯示，在hBMSC成骨分化過程中，EPHA2的mRNA及蛋白表達水平逐漸上升，見圖1。

注：A為Real-time PCR檢測結果，B為Western blot檢測結果

2.2 si-RNA下調hBMSC中EPHA2的表達

用EPHA2的si-RNA轉染hBMSC 48 h后收集細胞，EPHA2的 RNA和蛋白水平明顯下調，見圖2。

注：A為Real-time PCR檢測結果，B為 Western blot檢測結果；(1)兩組比較，P<0.05

2.3 EPHA2表達下調對hBMSC成骨分化的影響

在hBMSC成骨分化的第4天下調EPHA2表達顯著抑制了ALP活性，隨后在hBMSC成骨分化的第14天下調 EPHA2表達顯著抑制了鈣沉積，見圖3。下調EPHA2的水平顯著抑制了成骨分化的標志物OSX和OCN mRNA及蛋白的表達，見圖4。下調EPHA2的水平顯著抑制了成骨分化關鍵轉錄因子RUNX2 mRNA及蛋白的表達，見圖4。

注：A為ALP活性，B為鈣鹽沉積的定量，C為顯微鏡下鈣鹽沉積；(1)兩組比較，P<0.05

(1)兩組比較，P<0.05

3 討論

Ephrin-Eph信號通路由配體Ephrin和受體Eph組成， 配體Ephrin表達在細胞膜，包含一個保守的胞外受體結合區，在人體中已經發現5種EphrinA配體(EphrinA1- EphfinA5)和3種EphrinB配體(EphrinB1-EphrinB3)；受體Eph連接酪氨酸激酶，由胞外區、跨膜區及胞內區組成，在人體中已經發現9種EphA受體(EphA1-EphA8和EphA10)及5種EphB受體(EphB1-EphB4和EphB6)[8]。由于配體Ephrin和受體Eph均位于細胞膜表面，因此細胞與細胞之間的相互作用是啟動Ephrin-Eph信號通路的主要途徑。研究發現，Ephrin-Eph信號通路在神經系統發育、內皮細胞發生和腫瘤發生過程中均發揮著重要的作用，最近越來越多的研究也表明Ephrin-Eph信號通路在骨發生和穩態中也發揮著重要的作用[9]。研究表明，EphrinB2在破骨細胞中表達，而EphB4在成骨細胞中表達，成骨細胞中EphB4通過與破骨細胞中EphrinB2相互作用激活破骨細胞中的反式Ephrin-Eph信號通路從而抑制破骨細胞祖細胞分化為破骨細胞，而破骨細胞中EphrinB2通過與成骨細胞中EphB4相互作用激活成骨細胞中的順式Ephrin-Eph信號通路從而促進成骨分化[10]。體外研究也發現，過表達EphrinB2能夠促進成骨分化[11]。然而目前的研究主要集中在EphrinB配體和EphB受體在成骨分化中的作用，對于EphrinA配體和EphA受體在BMSC成骨分化中的作用研究很少，因此本實驗研究了EPHA2在hBMSC成骨分化中表達的動態變化及其在成骨分化中的作用。

本研究發現，在hBMSC成骨分化過程中，EPHA2的表達逐漸上升，提示其可能在hBMSC成骨分化過程中發揮重要作用。為了研究EPHA2在成骨分化中的作用，用si-RNA下調hBMSC中EPHA2的表達后進行成骨分化誘導，在成骨分化第4天， EPHA2的表達下調顯著抑制了早期成骨分化指標ALP活性；在在成骨分化第14天，下調EPHA2的表達顯著抑制了晚期成骨分化指標鈣沉積；進一步在分子水平上發現下調EPHA2的水平能夠抑制成骨分化標志物OSX和OCN及成骨分化關鍵轉錄因子RUNX2的表達，初步揭示了EPHA2調控hBMSC成骨分化的機制。本研究首次探索了EPHA2在hBMSC成骨分化中的作用，豐富了Ephrin-Eph信號通路在成骨分化中的作用研究，為hBMSC體外高效成骨分化提供了理論基礎。

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(2015-03-09收稿，2015-04-25修回)

中文編輯： 周 凌；英文編輯： 周 凌

The Role of EPHA2 in Osteogenic Differentiation of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

SUN Bo1， ZHANG Tao2， YANG Long1， LI Jing1， REN Houxiang1， SUN Qi1， WANG Jianji1, YE Chuan1

(1．GuiyangMedicalCollege，Guiyang550004，Guizhou，China; 2．DepartmentofOrthopedics,the117thHospitalofPLA,Hangzhou311201,Zhejiang,China)

Objective: To investigate the dynamic changes of EPHA2 expression in the osteogenic differentiation of human bone marrow mesenehymal stem cells(hBMSC) and the role of EPHA2 in the osteogenic differentiation. Methods: Cells were harvested on day 0, day 4, day 10 and day 14 during induction of osteogenic differentiation, RNA and protein was extracted and detected with Real-time PCR and Western blot analysis. siRNA for EPHA2 was used to silence the expression of EPHA2. Alkaline phosphatase (ALP) activity, calcium deposition, and the levels of OSX , OCN, RUNX2 were detected to observe the effect of EPHA2 on the osteogenic differentiation of hBMSC. Results: The expression of EPHA2 increased gradually in hBMSC osteogenic differentiation process. Down-regulation of EPHA2 inhibited ALP activity, calcium deposition and the expression of OSX, OCN and RUNX2 in hBMSC. Conclusions: The level of EPHA2 increases gradually in hBMSC osteogenic differentiation process, and EPHA2 can promote hBMSC osteogenic differentiation process through enhancing the expression of RUNX2.

EPHA2；human bone marrow mesenchymal stem cells；osteogenic differentiation；RUNX2

國家自然科學基金資助項目(81360232)； 貴州省衛生廳資助項目(gzwkj2010-1-042)； 貴州省國際科技合作項目(黔科合外G字2010-7)； 貴州省科技廳社發聯合基金項目(黔科合20103166)

時間：2015-05-21

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150521.1227.005.html

R318.17

A

1000-2707(2015)05-0433-05

**貴陽醫學院2012級碩士研究生

***通信作者 E-mail:yechuanchina@hotmail.com