三疣梭子蟹ftz-f1基因的克隆及相關核受體基因在蛻皮中的功能分析＊

張龍濤 呂建建 高保全 劉 萍① 付 萍

(1.中國水產科學研究院黃海水產研究所 青島 266071;2.上海海洋大學水產與生命學院 上海 201306;3.青島海洋科學與技術國家實驗室海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室 青島 266235)

核受體(nuclear receptor)是多細胞生物中含量最豐富的幾大類轉錄因子超家族之一,機體的生長發育、細胞分化以及許多生理、代謝過程都可歸于核受體與相應配體及其它調節因子的相互作用(Boulanger et al,2011)。在哺乳類中,ftz-f1可歸于核受體第5家族的甾類激素受體,這一家族也包括重要的甾類(類固醇)合成調控因子SF-1。ftz-f1首先是作為轉錄因子激活果蠅(Drosophila)早期胚胎形成階段分化基因fushi tarazu的同源異性盒(homeobox)而被發現的(Kuroiwa et al,1984)。隨后在其它許多物種中都發現了其同源類似物,如小鼠(Mus musculus)、家蠶(Bombyx mori)、煙草天蛾(Manduca sexta)和半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)等(Chai et al,2000;Choi et al,2005;Cao et al,2012;Shafi et al,2013)。它們在DNA結合結構域和ftz-f1 box區域都有相對的高度保守性,且在其它區域保守性較弱。蛻皮激素(20E)與核受體EcR以及核受體家族的類視黃酸受體 RXR形成異二聚體復合物(配體-受體)復合物是引發 20E初級應答基因表達的關鍵環節(Riddiford et al,2000)。20E-EcR-USP與共激活因子TAIMAN復合物結合于啟動子后,啟動早期的核受體應答基因的表達,如fzt-f1、HR3等(Crossgrove et al,2008)。通過這些早期應答的核受體基因進一步調控下游基因的表達,如天冬氨酸凋亡酶編碼基因、死亡激活因子等,導致蛻皮和變態過程中的細胞自噬和凋亡,從而調控蛻皮、變態等生理過程(Liu et al,2009;Spindler et al,2009)。此外,也有研究證明 ftz-f1基因在調控表皮基因的表達以及表皮蛋白的沉積上具有不可替代的作用(Yamada et al,2000)。然而有關ftz-f1基因在甲殼動物蛻皮中的功能研究尚無報道。

通過對本實驗室三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)轉錄組數據庫的篩選,獲得一個在三疣梭子蟹不同蛻皮時期顯著差異表達的核受體超家族基因ftz-f1的EST序列,克隆出該基因的全長cDNA序列并命名為PTNHr。采用生物信息學軟件分析該基因及其翻譯的氨基酸序列;借助Blast程序對與其相近物種的ftz-f1氨基酸序列同源性進行建樹分析。采用實時熒光定量技術對核受體基因ftz-f1、EcR和RXR在蛻皮周期中的表達情況進行分析,對 ftz-f1基因在去除單側眼柄后的表達情況進行分析,初步的闡明這些基因與蛻皮激素在蛻皮過程中的相互聯系。本研究結果將有助于補充ftz-f1、EcR和RXR基因在三疣梭子蟹中與蛻皮激素相互作用與調控關系,進一步的豐富三疣梭子蟹蛻皮過程分子調控機制的研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗所用三疣梭子蟹取自黃海水產研究所實驗基地日照開航水產養殖有限公司,體重為(32±5)g。暫養于室內圓柱形水泥池內,水池底面積為20m2,高度1.5m,池水深保持為20—30cm,水溫25°C左右,pH 8.7,溶解氧5.5mg/L。暫養3d,每日8: 00定時換掉1/2的水,16: 00投喂蛤類或者野雜魚(投喂量為蟹重的1/10)。

1.2 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

采用 Trizol法分別提取三疣梭子蟹各個組織的總RNA,用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗總RNA的質量和完整性。取等量的眼柄、肝胰腺和肌肉組織的總 RNA混勻,嚴格按照SMARTTMRACE Amplification Kit試劑盒的說明方法來合成3′和5′RACE的cDNA第一鏈。

1.3 轉錄組測序

選取不同蛻皮時期三疣梭子蟹眼柄組織 RNA。構建cDNA文庫,送交諾禾致源公司的Illumia Hiseq 2000平臺進行測序。從29889個unigene中總共篩選出 1389個蛻皮相關的功能基因,挑選出三疣梭子蟹ftz-f1基因序列做進一步的研究。

1.4 引物的設計

根據得到的三疣梭子蟹ftz-f1基因的EST序列,利用Primer Premier 5.0軟件基于RACE原理設計3′和5′末端特異性引物。根據 NCBI上已公布的三疣梭子蟹蛻皮激素受體基因(EcR JQ250795)和類視黃酸受體基因(RXR KF061043.1)設計熒光定量引物。實驗中所用到的引物由上海生工生物有限公司合成(表1)。

1.5 三疣梭子蟹ftz-f1基因全長cDNA的克隆及驗證

利用Advantage 2 PCR Kit試劑進行末端擴增,3′用通用引物 UPM和 NUP分別與相應的特異性引物NHr-F1和NHr-F2進行巢式PCR擴增(反應程序94°C 30s,68°C 30s,72°C 3min,27 個循環);同樣的程序以及相應的特異性引物進行5′端的擴增。

將 3′和 5′RACE 的擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳,切膠純化并且連接到PMD18-T載體,轉化入大腸桿菌Top ten感受態細胞中,在培養基中37°C過夜培養后,挑取陽性菌落繼續培養。進行菌落PCR后,挑選含有目的條帶的菌液送交上海桑尼公司測序。在該基因的兩端設計正反向引物,進行全長cDNA的驗證。

表1 實驗中所用到的引物Tab.1 The Sequences of the primer used in this experiment

1.6 三疣梭子蟹ftz-f1基因的生物信息學分析

利用NCBI中的BLAST主頁程序進行主要的核苷酸序列以及氨基酸序列的比對。利用 Vector NTI 11.0 進行核苷酸序列的拼接比對、冗余序列的去除、開放閱讀框的預測和氨基酸的翻譯。利用DNAMAN進行氨基酸序列的比對。利用SMRAT和InterProScan進行蛋白質跨膜區的分析。利用ProParam tool進行氨基酸殘基分析及蛋白質等電點、分子量等預測。利用MEGA 6.0 構建系統進化樹。

1.7 蛻皮過程的分期及去除單側眼柄實驗

采用解剖鏡觀察三疣梭子蟹游泳足表皮生長狀況的方法來區分不同蛻皮時期(沈潔等,2011)。取處于蛻皮間期、蛻皮前期、蛻皮后期的蟹各6只,分別取其眼柄、肌肉、肝胰腺、心臟、血液、鰓,每兩只螃蟹的組織放入一個 EP管中,存放于液氮中保存,用以之后的提取RNA和定量分析使用。

采用燙傷法去除三疣梭子蟹的單側眼柄。將燒紅的鑷子夾住蟹眼后紅色膨大部分基部(此處為眼柄竇憲復合體)1—2s,破壞單側眼柄的分泌及調控功能。用土霉素按照50—100mg/L的濃度進行全池的消毒。暫養7d后挑取處于蛻皮間期、前期、后期的蟹,取眼柄、肌肉、肝胰腺、心臟、血液、鰓組織,存放于液氮中保存。

1.8 三疣梭子蟹 ftz-f1、EcR和 RXR基因的表達定量分析

用研缽將采集的組織樣品在液氮中研磨,每個 EP管單獨研磨,然后在每 1mL Trizol試劑中加入 50—100mg的組織粉末,震蕩混勻分開標記后放入–80°C中保存。按照Trizol法提取RNA的步驟提取各個組織的總RNA,利用核酸定量儀和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質量和完整性,使用 Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (ROX)試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。

采用 FastStart Universal SYBR Green Master試劑,在 ABI 7500 Real Time PCR儀對各個組織的基因表達情況進行測定。反應體系為 10μL,包括 5μL的FastStart Universal SYBR Green Master (ROX)、0.1μL的正反向引物、3.8μL的PCR反應水、1μL的cDNA。反應程序為 95°C 10min,95°C 10s,60°C 34s,40 個循環;95°C 15s,60°C 1min,95°C 15s。為了得到更為可靠的定量分析結果,采用 geNorm軟件對β-actin和18S rRNA這兩個內參基因進行分析,結果顯示β-actin在蛻皮周期更為穩定。以β-actin基因作為內參,樣本和內參均設置3個重復,每個樣本為單個EP管中組織合成的模版。采用2–△△Ct方法計算各個基因的相對表達量,使用SPSS 19.0統計軟件進行單因素方差分析其顯著性,P＜0.05認為差異顯著。

2 結果

2.1 總RNA提取

采用Trizol法提取的各個組織的RNA,經 1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,呈現3條清晰的條帶,說明RNA完整性較好;用核酸定量儀檢測 RNA,其OD260/OD280均在1.9—2.0之間,說明RNA純度較高,可用于后續實驗。

2.2 三疣梭子蟹ftz-f1基因全長cDNA的克隆及驗證

該基因的EST序列長1165bp,用blastx對序列進行在線比對,結果顯示: 該序列與其它物種的ftz-f1的相似度在65%以上。3′RACE擴增結果得到大小為666bp的cDNA片段,5′RACE擴增結果得到大小為539bp的cDNA片段。將這兩個片段與已知EST序列進行拼接,去除冗余序列得到三疣梭子蟹 ftz-f1基因的全長cDNA序列,命名為PTNHr。對該基因全長 cDNA進行測序驗證,驗證出覆蓋開放閱讀框的1585bp序列準確、可靠。該cDNA序列全長為1763bp(GenBank登錄號KP299258),其中包括588bp的開放閱讀框(ORF),141bp的5’端非編碼區(UTR),1034bp的3’端非編碼區(UTR)(圖1)。

2.3 三疣梭子蟹ftz-f1基因序列的生物學分析

DNAstar軟件分析表明,三疣梭子蟹 ftz-f1基因編碼一個由 195個氨基酸組成的蛋白質,分子量為22.8kDa,理論等電點為 6.35。該蛋白具有核受體家族標志的 DNA 結合域(DBD)和配體結合域(LBD)。ProtParam tool軟件分析表明,ftz-f1蛋白帶有負電的氨基酸殘基為26個(Asp和Glu),帶有正電的氨基酸殘基為 23個(Arg和 Lys),不穩定系數為27.7,親水性平均數為–0.291,屬于穩定蛋白。使用 SMRAT和InterProScan在線軟件分析,ftz-f1基因翻譯的蛋白質結構中無跨膜結構域。

2.4 三疣梭子蟹ftz-f1基因的同源性分析

BLAST同源性分析三疣梭子蟹ftz-f1基因的氨基酸序列,發現與刀額新對蝦(Metapenaeus ensis)同源性達到75.4%,與切葉蟻(Acromyrmex echinatior)、德國小蠊(Blattella germanica)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)、煙草天蛾(Manduca sexta)、赤擬谷盜(Tribolium castaneum)的同源性分別為66.0%、67.5%、61.9%、61.9%和 66.0%(圖2)。

圖1 三疣梭子蟹ftz-f1基因cDNA全長及其編碼的氨基酸序列Fig.1 ftz-f1 nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of P.trituberculatus

圖2 三疣梭子蟹ftz-f1氨基酸序列與其它物種的ftz-f1氨基酸序列比對Fig.2 The amino acid sequence of P.trituberculatus ftz-f1 alignment with other species

利用 MEGA6.0軟件進行系統進化分析,構建系統進化樹(圖3)。結果顯示13個物種中,三疣梭子蟹與刀額新對蝦緊密聚為一支,之后與赤擬谷盜、德國小蠊親緣關系較近。在昆蟲中,黑腹果蠅與嗜鳳梨果蠅緊密聚為一支,家蠶與煙草天蛾等聚為一支。

圖3 MEGA 6.0軟件采用鄰接法構建的三疣梭子蟹與其它物種的ftz-f1氨基酸的系統進化樹Fig.3 NJ phylogenetic tree of amino acid sequence of P.trituberculatus ftz-f1 and other species made by MEGA 6.0

2.5 三疣梭子蟹三個核受體基因的表達情況分析

2.5.1 三疣梭子蟹不同蛻皮時期,各個組織中ftz-f1、EcR和RXR基因的表達情況 采用實時熒光定量PCR方法,分析三疣梭子蟹各個組織中ftz-f1基因在不同的蛻皮時期的表達特征。結果表明,眼柄中ftz-f1基因在蛻皮后期的表達量明顯高于蛻皮間期和蛻皮前期;但是肝胰腺、心臟和鰓中ftz-f1基因在蛻皮后期卻明顯低于蛻皮間期和蛻皮前期;血細胞和肌肉中該基因的表達量在蛻皮各個時期的變化不明顯(圖4)。

三疣梭子蟹各個組織中EcR基因在不同的蛻皮時期的表達情況: 在眼柄、心臟和鰓中,三疣梭子蟹 EcR基因的表達量均為蛻皮前期高于蛻皮間期和蛻皮后期;在血細胞、肌肉和肝胰腺中,EcR基因的表達量為蛻皮后期高于蛻皮間期和蛻皮前期(圖5)。

三疣梭子蟹各個組織中 RXR基因在不同的蛻皮時期的表達情況: 眼柄中 RXR基因在蛻皮后期表達量低于蛻皮間期和蛻皮前期;血細胞、肝胰腺、心臟和鰓中 RXR基因在蛻皮后期表達量明顯高于蛻皮間期和蛻皮前期;肌肉中 RXR基因表達量在蛻皮各個時期中變化不明顯(圖6)。

圖4 三疣梭子蟹ftz-f1基因在不同蛻皮時期各個組織中的表達分布情況Fig.4 Distribution of ftz-f1 gene expression in different tissues in different molt stages

圖5 三疣梭子蟹EcR基因在不同蛻皮時期各個組織中的表達分布情況Fig.5 Distribution of EcR gene expression in different tissues in different molt stages

圖6 三疣梭子蟹RXR基因在不同蛻皮時期各個組織中的表達分布情況Fig.6 Distribution of RXR gene expression in different tissues in different molt stages

2.5.2 三疣梭子蟹 ftz-f1基因在不同蛻皮時期,去除單側眼柄與正常相對比的表達情況 對去除單側眼柄的三疣梭子蟹在不同蛻皮時期,與相應的正常對照組進行實時熒光定量。結果顯示: 在蛻皮前期與蛻皮間期,去除單側眼柄后 ftz-f1基因的表達量在整體上明顯低于相應的正常對照組,并且表達差異較大(圖7、圖8)。但是在蛻皮后期,去除單側眼柄后ftz-f1基因的表達量在肝胰腺、心臟和鰓中的表達量卻是高于正常對照組(圖9)。

圖7 去除單側眼柄后,ftz-f1基因在三疣梭子蟹蛻皮前期與正常對照各個組織中的相對表達情況Fig.7 After single eye- ablation,distribution of ftz-f1 gene expression in different tissues of pre-molt stage compare to those in normal condition

圖8 去除單側眼柄后,ftz-f1基因在三疣梭子蟹蛻皮間期與正常對照各個組織中的相對表達情況Fig.8 After single eye- ablation,distribution of ftz-f1 gene expression in different tissues in inter-molt stage compare to that in normal condition

圖9 去除單側眼柄后,ftz-f1基因在三疣梭子蟹蛻皮后期與正常對照各個組織中的相對表達情況Fig.9 After single eye- ablation,distribution of ftz-f1 gene expression in different tissues of post-molt stage compare to normal condition

3 討論

核受體是配體依賴性轉錄因子超家族,能夠直接與 DNA結合,調節下游靶基因的表達,與機體的代謝、生殖和發育等多種生理過程密切相關(Mckenna et al,2002)。fzt-f1基因屬于核受體第5家族A組,該組內的核受體基因是重要的甾類激素合成調控因子(Lu et al,2001)。fzt-f1基因在魚類中研究較為深入,但是在甲殼類中卻很少有報道(Liu et al,1997;Masuda et al,1998;Lin et al,2000)。本實驗克隆得到三疣梭子蟹 fzt-f1基因,該基因具有核受體基因特有的DNA結合結構域(DBD)和配體結合區(LBD)。該基因序列與刀額新對蝦克隆出的fzt-f1蛋白同源性達到75.4%,系統進化分析中也與刀額新對蝦聚為一支。

蛻皮激素對于甲殼類的蛻皮過程起著至關重要的作用。已有的研究證明,蛻皮激素在血液中是以20-羥蛻皮酮(20E)形式存在。20E在血液內的濃度在蛻皮前期逐漸升高,臨近蛻皮時,形成一個峰值,然后濃度再迅速下降(Wang et al,2000;Watson et al,2001)。整個調控過程是通過20E-EcR-RXR配體-受體復合物引發的應答基因級聯放大反應完成,20E與蛻皮激素受體EcR和類視黃酸受體(RXR)異二聚體復合物在細胞核內形成轉錄復合體,進而引發20E初級應答基因(如 fzt-f1、HR3等)表達(Durica et al,1999;LeBlanc,2007)。初級反應基因編碼的轉錄因子誘導表達的20E次級應答基因級聯放大20E信號,進而調控下游基因表達。

實時定量分析ftz-f1基因在不同蛻皮時期各個組織中的相對表達情況,結果表明: 眼柄中 ftz-f1基因的表達量為蛻皮后期高于蛻皮前期和蛻皮間期,而在肝胰腺、心臟和鰓組織中ftz-f1基因的表達量為蛻皮后期低于蛻皮前期和蛻皮間期。推測在眼柄中,該基因與20E呈負調控關系,而在肝胰腺、心臟和鰓中該基因與20E呈正調控關系。由于眼柄中X器-竇腺復合體合成蛻皮抑制激素(MIH)(Nakatsuji et al,2004),因此該基因在眼柄中的表達可能與 MIH更為相關。對核受體基因EcR在蛻皮周期中的定量分析結果顯示: 眼柄、心臟和鰓組織中,EcR基因在蛻皮前期表達量高于其它兩蛻皮時期,表達模式與20E在蛻皮時期的濃度變化相似,說明了該基因與20E的協同調節作用,這與日本囊對蝦(Marsupenaeus japonicus)的研究結果一致(Asazuma et al,2007)。在血細胞、肝胰腺和肌肉中,EcR基因的表達模式為蛻皮后期高于蛻皮前期高于蛻皮間期,出現了與20E濃度不協調的現象。也有學者發現,在藍蟹(Callinectes sapidus)體內 EcR基因的表達量與20E在血淋巴中的濃度并不協同,關于這一現象的解釋還有待于進一步的研究(Techa et al,2013)。核受體基因RXR在蛻皮周期的定量結果顯示: RXR與ftz-f1基因在肝胰腺、心臟和鰓組織中的表達模式上呈現出完全相反的趨勢,這預示著RXR和fzt-f1這兩個基因之間可能存在典型的抑制調控作用。而RXR與EcR基因在整體上呈現相似的表達模式,這與中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)和中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)中的研究相一致(Priya et al,2009;王瑤等,2013)。由于RXR蛋白和EcR蛋白是作為20E異二聚體復合物的組成部分,因此這兩個基因在三疣梭子蟹的蛻皮功能上也更趨向于協同調節作用。

甲殼類蛻皮激素是由 Y器官合成與分泌,而 Y器官則受 MIH的調控(羅榮生等,1990;Gong et al,2015)。眼柄中 X器-竇腺復合體是 MIH制造與分泌的器官,去除單側眼柄將會造成 20E濃度的上升(Devaraj et al,2006;Wang et al,2013)。去除單側眼柄后對 fzt-f1基因在各個組織中的表達量進行分析,發現在去除單側眼柄后該基因的表達量在各個蛻皮時期組織中出現明顯下降;說明 20E濃度的升高對ftz-f1基因的表達起到了明顯的抑制作用。由此可以推測出,ftz-f1基因在蛻皮過程中具有重要的作用,與20E具有緊密的聯系,且更可能為抑制調控關系。

4 結論

本研究成功克隆出了三疣梭子蟹ftz-f1基因全長cDNA序列,并進行了生物信息學的分析。對三疣梭子蟹 ftz-f1基因以及相關的核受體基因EcR和 RXR,在蛻皮周期各個組織中的表達情況進行了分析并預測之間可能存在的聯系。本實驗證明了ftz-f1基因在蛻皮過程中的調控作用,并對與三個重要的蛻皮功能相關核受體基因之間的聯系進行了初步的探討。有關 ftz-f1基因以及核受體基因在蛻皮中的功能,還需要更多的研究。關于核受體基因之間的相互作用與聯系也需要更為深入的生物學技術來進行研究。

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