水楊酸對蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)生長及抗逆相關基因的影響＊

丁聰聰 徐年軍① 張 琳 孫 雪 李亞鶴

(1.寧波大學海洋學院 寧波 315211;2.浙江省海洋生物工程重點實驗室 寧波 315211)

小球藻(Chlorella)為綠藻門(Chlorophyta)、Trebouxiophyceae綱、小球藻科(Chlorellaceae)的一類單細胞藻類,在自然界廣泛分布。小球藻中常見種主要有普通小球藻(C.vulgaris)、蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)、橢圓小球藻(C.ellipsoidea)等。蛋白核小球藻因生長快、易培養,及其獨有的具有很高藥用價值的小球藻生長因子(CGF)而廣受關注。溫度作為重要的環境因素之一,在小球藻生長和光合作用中發揮了重要作用 (歐陽崢嶸等,2010)。水楊酸作為一種新型植物激素已成為植物體內的重要信號分子來誘導逆境防御機制,參與并調節逆境脅迫。大量的研究證實水楊酸可以提高植物對低溫(Lei et al,2010)、高溫(Li et al,2015)、鹽害(Jayakannan et al,2015)等脅迫的抗性。

熱激蛋白(heat stock proteins,HSPs)作為植物體對逆境短期響應的一種分子伴侶,能阻止細胞內變性蛋白發生聚集,并對其進行修復(Fu et al,2009),可提高機體耐熱性,減輕逆境脅迫對機體的傷害( Koizumi et al,2014)。大量研究發現,逆境條件如高溫、高鹽、重金屬、干旱和病害等多種脅迫都可誘導HSPs的合成(Timperio et al,2008;周向紅等,2010)。其中 HSP70是熱激蛋白家族中的重要成員,參與真核細胞新生肽段折疊、定位等正常生命活動過程,以及DNA修復、抗氧化活性、光保護物質等多種應激反應。藻類中關于HSP的研究已經比較多,其中褐藻門的裙帶菜(Undaria pinnatifida)和海帶(Laminaria japonica)(Henkel et al,2008;Fu et al,2009)、紅藻門的龍須菜(Gracilaria lemaneiformis)(Gu et al,2012)、綠藻門的孔石莼(Ulva pertusa)(Tominaga et al,2010)等都有HSP70基因的相關報道。Liu等(2014)克隆了普通小球藻 HSP90基因,但目前尚無蛋白核小球藻HSP70基因克隆和表達的相關報道。

磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerate kinase,PGK)是生物體內糖酵解過程中的關鍵酶,缺乏此酶可引起生物體代謝功能紊亂。磷酸甘油酸激酶在催化1,3-二磷酸甘油酸轉變成 3-磷酸甘油酸時,產生一分子的ATP。逆境條件下,植物需消耗大量能量來提高抗性,而能量主要來源為糖酵解途徑(Wang et al,2009)。目前關于PGK的研究主要集中在動物方面(Wang et al,2014),植物方面有部分蛋白組學相關研究(蔣際謀等,2014),基因表達水平研究較少(Ding et al,2014),而藻類中的研究更少。Shingaki-Wells等(2011)發現,缺氧環境下,水稻胚芽鞘中PGK活性提高,并證實了在適應缺氧環境的過程中水稻胚芽鞘酵解和酒精發酵增強。而高溫下水楊酸對糖代謝分子水平的影響方面的研究還很少。

本文從蛋白核小球藻中分離鑒定了其 HSP70和PGK基因序列,并研究了高溫脅迫下水楊酸對蛋白核小球藻生長、可溶性糖和蛋白含量及 HSP70和PGK基因轉錄水平的影響。相關研究結果可為水楊酸在抗高溫脅迫方面的應用及其作用機制等提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

蛋白核小球藻 820藻株來自寧波大學海洋生物工程重點實驗室藻種室,培養基為 f/2培養基,培養溫度為25°C,光照強度為3500 lx,光照周期為 12L:12D。

1.2 引物序列

從GenBank數據庫中搜索萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、普通小球藻等的 HSP70序列,利用ClustalX 1.83軟件進行比對,根據其保守核苷酸序列設計簡并引物,擴增出兩條基因的部分 cDNA序列,然后根據這部分cDNA序列使用Primer Premier 5.0軟件來設計5′ RACE和3′ RACE引物(所用各引物序列見表1)。

表1 蛋白核小球藻HSP70和PGK基因克隆和熒光定量所用引物Tab.1 Primer sequences of cloning and real-time PCR for HSP70 and PGK in C.pyrenoidosa

1.3 HSP70部分cDNA片段的克隆

首先8000 r/min離心5min收集對數期的蛋白核小球藻,無菌水洗滌藻細胞后再次離心。再按 Trizol試劑說明提取小球藻總RNA,檢測總RNA質量合格后根據 PrimeScript?RT reagent Kit (TaKaRa)反轉錄試劑盒說明書反轉錄為cDNA,以該cDNA為模板利用簡并引物進行 PCR擴增。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物后,GenClean瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段,連接至 pMD18-T載體,連接后的產物導入大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態細胞,陽性克隆送去華大基因(上海)科技服務有限公司測序。

1.4 HSP70的RACE擴增

利用 SMARTerTMRACE cDNA擴增試劑盒(Clontech公司)獲得基因的 5’端序列。根據PrimeScript?RT reagent Kit(Takara)反轉錄試劑盒說明書進行3’ RACE cDNA的制備,3’ RACE adaptor代替試劑盒中的OligodT Primer和Random 6 mers進行反轉錄反應。以合成的cDNA為模板,特異性引物F、接頭引物AP1作為上下游引物進行3’ RACE PCR擴增。

1.5 HSP70和PGK基因全長的獲得及驗證

將測序得到的HSP70基因的部分片段、5’ RACE和3’ RACE片段一起拼接得到其全長cDNA序列。PGK基因序列來自實驗室已測蛋白核小球藻的轉錄組測序結果。為了驗證兩條基因序列的正確性,再從基因兩端的非翻譯區(UTR)區設計一對引物,利用Pyrobest Polymerase (TaKaRa)進行PCR擴增。產物的回收、轉化等同1.3,將陽性克隆送去測序。

1.6 HSP70和PGK基因的序列分析

將HSP70和PGK基因在NCBI的Blastx中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blastx)進行同源性比對;用ORF Finder (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)推測開放閱讀框;利用 ExPASy Proteomics Server(http: //web.expasy.org)進行氨基酸序列分析;利用ClustalX和MEGA 5.0軟件中的鄰接法(NJ)分別進行多序列比對和系統進化樹構建。

1.7 HSP70和PGK基因轉錄水平的定量分析

樣品處理: 處理溫度為 35°C,在處于對數中期的蛋白核小球藻中加入水楊酸母液,使其終濃度分別為0、1、5、10、15和20μg/mL,每組設三個平行,培養12h和24h后取樣。根據獲得的HSP70和PGK基因設計熒光定量PCR引物(表1)。以TATA結合蛋白(TATA-binding protein,TBP)做內參基因,根據其cDNA序列設計熒光定量PCR引物(表1)。將TBP、HSP70和PGK的熒光定量PCR引物擴增序列進行克隆與測序鑒定。

熒光定量PCR采用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒,反應體系: 10 μL SYBR Premix Ex Taq,正反向引物(10 μmol/L)各 0.4 μL,2 μL cDNA 模板,RNA-free水補足體積至 20 μL。PCR循環參數為 95°C預變性2min;然后按 95°C 變性 15s,55°C復性 15s,72°C延伸20s的程序進行40個循環;PCR結束后進行熔解曲線分析 95°C 15s,60°C 15s,95°C 15s(一個循環)。每個樣品三個平行。采用2–ΔΔCt方法分析HSP70和PGK的相對表達量。并用Origin 7.0軟件進行差異顯著性分析。

1.8 生長及生化指標的測定

不同濃度水楊酸處理蛋白核小球藻24h和48h后,利用分光光度計測定 680nm下藻的吸光值。根據吸光值與藻細胞密度的標準曲線圖計算出細胞密度,并根據μ=(lnN–lnN0)/(t–t0)計算藻的比生長速率。其中N0為初始培養時間t0時的細胞密度,N為t時的細胞密度?？扇苄蕴呛繙y定采用硫酸蒽酮法,可溶性蛋白含量測定用考馬斯亮藍法(李合生,2000)。

1.9 統計分析

數據處理和統計分析采用Origin7.0軟件,差異顯著水平檢驗用的是單因素方差分析(one-way ANOVA),P＜0.05為差異顯著,P＜0.01為差異極顯著。

2 結果

2.1 HSP70和PGK基因的擴增

使用 HSP70簡并引物擴增得到 1518 bp長的cDNA 部分片段,將其與 3′ RACE擴增得到的長為611 bp的產物與長900 bp的5′ RACE產物一起拼接,得到全長為 2405 bp的 HSP70基因(GenBank號:KP694307),包括1959 bp的開放閱讀框(ORF)、60 bp的 5’端非編碼區(5’-UTR)和 386 bp 的 3′端非編碼區(3’-UTR)。其中ORF區編碼652個氨基酸,Expasy分析顯示其分子量大小為 71.59 kDa,理論等電點為5.12。利用引物 F4和 R4擴增得到全長 1664 bp的PGK基因(GenBank號: KP694308),包括 35 bp的5’-UTR,1398 bp 的 ORF 和 231 bp 的 3’-UTR,其中ORF編碼465個氨基酸,推測其分子量為49.16 kDa,理論等電點為7.01。

2.2 HSP70和PGK基因的分析

將由HSP70的cDNA序列推導出的氨基酸序列與其它物種的 HSP70氨基酸序列進行多序列比對(圖1),結果表明該蛋白核小球藻與普通小球藻和小球藻 C.variabilis的同源性均高達 91%,與擬南芥(Arabidopsis thaliana)的同源性為83%。我們在HSP70氨基酸的多序列比對中發現序列保守性強的區域,包含了三個典型的HSP70家族簽名基序,其氨基酸殘基序列分別為 10—17(IDLGTTYS)、203—216 (IFDLGGGTFDVSLL)、339—354(VVLVGGSTRIPKVQQ),及細胞質定位的 C-末端的特征基序(EEVD)。

利用鄰接法構建了基于 HSP70氨基酸序列的系統進化樹。進化樹分析顯示,蛋白核小球藻 HSP70氨基酸序列與普通小球藻和小球藻C.variabilis親緣關系最近,先聚為一支,然后再與其它植物聚為一 組,符合其傳統的分類地位(圖2)。

圖1 蛋白核小球藻與其它物種的HSP70氨基酸的多序列比對結果Fig.1 Alignment of HSP70 amino acid sequences of C.pyrenoidosa and other species

圖2 不同物種基于HSP70氨基酸序列的系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of different species based on HSP70 amino acid sequences

Blastx分析結果表明蛋白核小球藻的PGK氨基酸序列與團藻(Volvox carteri f.nagariensis)有75%的相似性,與萊茵衣藻(Ch.reinhardtii)相似性為73%。氨基酸多序列比對中連續序列YVNDAFG、AHRAHAST、WNGPMGVFEF、TIIGGGDSV、MSHISTGGGASLEL保守性較強(圖3)。分析基于PGK氨基酸序列構建的進化樹,發現蛋白核小球藻與萊茵衣藻和團藻親緣關系最近,聚為一支,其它高等植物則聚在一起(圖4)。以上結果表明不同物種的HSP70和PGK在進化過程中是比較保守的,其氨基酸序列同源性較高。

圖3 蛋白核小球藻與其它物種的PGK氨基酸的多序列比對結果Fig.3 Alignment of PGK amino acid sequences of C.pyrenoidosa and other species

2.3 不同濃度水楊酸對HSP70和PGK基因表達的影響

不同濃度水楊酸對HSP70(圖5)和PGK(圖6)基因表達的影響在12h和24h均呈現相同的趨勢。水楊酸添加后,HSP70和 PGK基因表達量均增加,在 0—10μg/mL濃度范圍內兩基因的表達水平隨著水楊酸濃度的升高而增加,隨著水楊酸濃度的繼續升高兩者的表達量有所下降。其中10 μg/mL水楊酸濃度下兩基因的表達量最高。

在水楊酸處理12h和24h時,HSP70的相對表達量與對照組均有顯著性差異(P＜0.05),且 12h時(圖5A)1、5、10、15μg/mL水楊酸處理組與對照組差異極顯著(P＜0.01);而24h時(圖5B)5個處理組與對照組差異均極顯著(P＜0.01)。在水楊酸處理 12h時,10μg/mL水楊酸濃度組中 HSP70表達量為對照組的2.57倍,在24h則為對照組的1.71倍。

在水楊酸處理12h(圖6A)和 24h(圖6B)時,PGK的相對表達量在1、5、10、15 μg/mL水楊酸處理組和對照組均有顯著性差異(P＜0.05),且5、10 μg/mL水楊酸處理組與對照組差異極顯著(P＜0.01)。12h時,10μg/mL水楊酸濃度下 PGK表達量為對照組的1.56倍,24h則為對照組的1.79倍。以上結果說明水楊酸促進了HSP70和PGK的表達,且10 μg/mL效果最好。

圖4 不同物種基于PGK氨基酸序列構建的系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of different species based on PGK amino acid sequences

圖5 不同濃度水楊酸對高溫培養蛋白核小球藻HSP70基因表達的影響(A: 12h,B: 24h)Fig.5 Effects of salicylic acid concentration on HSP70 relative expression of C.pyrenoidosa under high temperature (mean±SD)(A: 12h,B: 24h)

圖6 不同濃度水楊酸對高溫培養蛋白核小球藻PGK基因表達的影響(A: 12h,B: 24h)Fig.6 Effects of salicylic acid concentration on PGK relative expression of C.pyrenoidosa under high temperature (mean±SD)(A: 12h,B: 24h)

2.4 不同濃度水楊酸對蛋白核小球藻生長的影響

不同濃度水楊酸處理對高溫脅迫后蛋白核小球藻生長有明顯的影響(圖7)。隨著水楊酸濃度的升高,蛋白核小球藻比生長速率(μ)均有所提高,且在一定范圍內隨著水楊酸濃度的增加而增加。其中高溫脅迫24h時(圖7A),5和10μg/mL水楊酸添加后,藻的比生長速率均顯著高于對照組(P＜0.05),且在5 μg/mL濃度下達到最高,為對照組的 2.55倍。在 48h時,5-20μg/mL水楊酸添加后藻的比生長速率顯著高于對照組(P＜0.05),而在 10μg/mL濃度下最高,為對照組的 2.07倍。該結果說明一定濃度的水楊酸促進了高溫培養蛋白核小球藻的生長,其中5和10 μg/mL水楊酸促進作用最好。

2.5 不同濃度水楊酸對可溶性蛋白和可溶性糖含量的影響

不同濃度水楊酸處理對高溫脅迫后蛋白核小球藻可溶性蛋白(圖8)和可溶性糖含量(圖9)有一定的影響。隨著水楊酸濃度的增加,小球藻的可溶性蛋白和糖含量均有所增加,且在一定濃度范圍內,蛋白和糖含量的增加量與水楊酸濃度呈正相關。其中高溫脅迫24h和48h時,5個水楊酸處理組藻的蛋白含量均高于對照組(P＜0.05),且在 10μg/mL水楊酸組中最高,分別是對照組的1.51和1.18倍。

在高溫脅迫24h時,僅1、5、10μg/mL水楊酸處理組藻的可溶性糖含量有所增加(P＜0.05);在48h時,5個水楊酸處理組藻的可溶性糖含量均高于對照組。在10μg/mL水楊酸組中,小球藻的糖含量最高,分別是對照組的1.10 和1.34倍。以上結果說明一定濃度的水楊酸促進了蛋白核小球藻可溶性蛋白和可溶性糖含量的增加。

3 討論

圖7 不同濃度水楊酸對高溫培養蛋白核小球藻生長的影響(A: 24h,B: 48h)Fig.7 Effects of salicylic acid concentration on C.pyrenoidosa grown in high temperature (mean±SD)(A: 12h,B: 24h)

圖8 不同濃度水楊酸對高溫培養蛋白核小球藻可溶性蛋白含量的影響(A: 24h,B: 48h)Fig.8 Effects of salicylic acid concentration on soluble protein content of C.pyrenoidosa under high temperature (mean±SD)(A: 12h,B: 24h)

藻類在生長過程中往往受到多種逆境(高溫、低溫、高鹽等)的影響,作為一種脅迫生物指示物,HSPs已得到廣泛關注(Dahlhoff,2004;Elyse Ireland et al,2004)。在逆境脅迫狀態時,生物體大量表達HSPs阻止變性蛋白的聚集,修復變性蛋白,并運送未成熟的蛋白質完成包裝、代謝、修復,增加細胞抗逆性。有研究發現水楊酸參與植物的抗熱反應,它可通過調節活性氧、抗氧化物質含量及活性來提高植物抗逆性(Qu et al,2013)。何亞麗等(2002)研究認為,SA通過促進植物在高溫脅迫下合成大量的熱激蛋白,保持較高的超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性,提高抗氧化能力,降低高溫對細胞產生的傷害,從而提高植物抗熱性。Pan等(2006)發現豌豆受到高溫脅迫時,SA處理可誘導 HSP70的合成。而番茄在面臨高溫環境時,外施SA可誘導HSP70 mRNA轉錄和熱休克因子基因表達增強,積累HSP70蛋白(Snyman et al,2008)。本研究發現水楊酸添加后,蛋白核小球藻 HSP70的表達量不同程度地得到提高,且在水楊酸處理濃度為10 μg/mL時HSP70表達量最高。該結果說明高溫條件下水楊酸可以促進 HSP70的轉錄水平表達,從而大量合成 HSP70蛋白,修復受損細胞使生物體抵御高溫環境,從而維持正常的生命活動狀態。

圖9 不同濃度水楊酸對高溫培養蛋白核小球藻可溶性糖含量的影響(A: 24h,B: 48h)Fig.9 Effects of salicylic acid concentration on soluble sugar content of C.pyrenoidosa under high temperature (mean±SD)(A: 12h,B: 24h)

高溫條件下植物呼吸作用急劇升高,分解代謝增強,能量消耗增加。Gammulla等(2010)認為高溫對水稻糖酵解途徑具有負面的影響,且降低細胞能量的產生。磷酸甘油酸激酶(PGK)的編碼基因在整個高溫處理過程中表達持續上調(Zhang et al,2012)。而關于水楊酸處理后 PGK的變化研究較少。Suzuki等(2014)認為水楊酸促進了 PGK 的表達,Fahraji等(2014)研究則表明水楊酸顯著刺激 PGK參與種子的萌發。本研究中PGK在水楊酸處理12h和24h時表達增強,反映了高溫脅迫過程中,水楊酸促進細胞呼吸,減輕高溫逆境脅迫對機體產生的傷害。

高溫條件下小球藻生長受到脅迫,新陳代謝活性降低,比生長速率較小,而水楊酸添加后比生長速率升高,高溫對生長的抑制作用得到緩解,這與小麥中的研究結果一致(Shakirova et al,2007)。高溫下淀粉水解作用增強,可溶性糖含量升高,而淀粉的水解為呼吸作用提供能源,增加細胞滲透壓,對細胞產生保護作用。有研究認為,高溫處理下可溶性糖含量下降(Chaitanya et al,2001)。而本研究中高溫脅迫 48h比 24h可溶性蛋白含量有所提高,高溫下體內可溶性蛋白含量的提高可增加細胞滲透勢等,維持機體正常代謝,提高細胞抗逆性,抵御不良環境脅迫。本研究中經水楊酸處理后可溶性糖和蛋白含量均呈現不同程度的提高,說明水楊酸通過調節滲透調節物質,改變質膜透性,從而提高機體對逆境脅迫的抗性,與 Czerpak等(2001)的研究結果相符。

綜上所述,本文克隆了蛋白核小球藻 HSP70和PGK全長基因,并研究了水楊酸對高溫脅迫下蛋白核小球藻中HSP70和PGK的表達、及藻的生長、生化指標的影響。結果表明適宜濃度的水楊酸對蛋白核小球藻高溫脅迫具有一定的緩解作用,且在一定程度上增強了HSP70和PGK的表達,其中5—10 μg/mL時作用最顯著,這為利用水楊酸緩解小球藻溫度脅迫的研究提供了一定的資料。

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