5種石斑魚核糖體DNA ITS1序列及其分子系統進化關系

周愛國 , 謝少林 , 陳金濤 , 陳言峰, 鄒記興

(1.華南農業大學 動物科學學院, 廣東 廣州 510642; 2.清遠市北江水產科學研究所, 廣東 清遠 511510;3.佛山科學技術學院 生命科學學院, 廣東 佛山 528231)

核糖體DNA ITS1(The first internal transcribed spacer of ribosomal DNA, rDNA)基因是位于18S與5.8S rDNA的間隔區, 進化速率中等, 是研究近源種、復合種及種內生物型間親緣關系和系統發育的良好分子標記, 對于種間分化時間短, 親緣關系較近的石斑魚物種, 該標記可以很好揭示其物種間的親緣關系[1]。然而, 目前關于 ITS1序列的研究主要集中在無脊椎動物和植物[2-6]。在魚類研究上也有相應的報道, Pleyte 等[7]采用ITS1標記對鮭屬魚類7個種研究, 發現其系統進化關系分析結果與形態學、同工酶等研究結果一致。而邱凡等[8]利用ITS1 部分序列研究鯖科(Scombrida)魚類時發現其系統進化關系與形態學上的分類結果存在分歧, 并對鯖科魚類分類關系進行了澄清; 國外學者也將 ITS1 部分序列成功應用到魚類系統發育和進化分析中, 解決了一些物種長期存在爭議的分類問題[9-10]。張源真等[11]利用 ITS-1序列分析部分鳚亞目魚類的分子系統進化關系時發現研究結果與形態學分類一致, 種間具有高度變異性, 可以作為物種分類及鑒別的分子依據。而利用ITS1序列作為分子遺傳標記對石斑魚進行系統發育關系的研究相對較少。Guo等[12]研究云紋石斑魚(Epinephelus moara)和褐石斑魚(E.bruneus)的親緣關系時發現核糖體DNA ITS1 序列是一種穩定可靠的分子標記。

本研究旨在利用rDNA ITS1序列作為分子鑒定手段以區別形態上較為相似的 5種石斑魚(青石斑魚(E.awoara)、點帶石斑魚(E.malabaricus)、六帶石斑魚(E.sexfasciatus)、寶石石斑魚(E.areolatus)、巨石斑魚(E.tauvina)種類, 并以麗魚科(Cichlidae),羅非魚屬(Oreochromis)的尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)為外群, 構建 3種分子系統樹, 以期從分子水平獲得這 5種石斑魚的系統進化關系, 為生產上的良種選育和雜交選配提供分子生物學方面的依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料的種類及來源見表1, 其中外群尼羅羅非魚的序列來自GenBank。

表1 研究材料種類及其來源Tab.1 The species and sources of materials

1.2 試驗方法

1.2.1 總DNA提取

取適量尾鰭或肌肉組織, STE洗滌3次, 離心條件為3 000 r/min, 每次離心10 min; 倒去上清, 將組織轉移到滅菌的勻漿器中, 加入 1 mL STE, 勻漿;將勻漿后的組織懸液轉移至5 mL EP管, 加入3 mL細胞裂解液, 搖勻直至出現黏狀物; 加入質量濃度為10 mg/mL的RNase A至終質量濃度20 μg/mL, 于37℃消化3 h; 加入質量濃度為20 mg/mL的蛋白酶K 至終質量濃度 100 μg/mL, 50℃消化過夜; 次日以酚/酚-氯仿/異戊醇-氯仿/異戊醇各抽提 1次; 冰乙醇沉淀, 用吸頭挑出DNA沉淀, –20℃70%乙醇洗1次, 置 4℃冰箱中使之緩慢干燥; 干燥后溶于適量TE中, 用紫外分光光度計測定其純度及濃度。

1.2.2 PCR擴增

PCR擴增所用引物為自行設計: 正向引物:5’-GTTCCCCTTGAACGAGGA ATTC-3反向引物:5’-CGCATTTCGCTGCGTTCTTC-3’, 它們分別為18SrDNA的5’端和5.8SrDNA的3’端的保守序列, 由上海生物工程公司合成。PCR擴增反應參照Williams等[13]、Welsh[14]的方法。每一樣品的反應總體積50 μL, 其中包括6 μL PCR緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl, pH9.0, 50 mmol/L KCl, 22.5 mmol/L MgCl2,0.01%的明膠), 2 μL dNTP混合液(每種 dNTP 0.1 mmol/L), 4 μL 的引物(0.2 μmol/L), 4μL 基因組DNA(50 ng/uL), 2 μL Taq酶(2單位), 32 μL 的蒸餾水。擴增反應條件為: 95℃ 預變性10 min, 94℃ 變性60 s, 50℃退火30 s, 72℃延伸1.5 min, 共計40個循環, 最后72℃延伸10 min。

1.2.3 DNA序列測定

擴增產物經 2.0%的低熔點瓊脂糖回收純化, 克隆于M13噬菌體載體, 具體方法參見金冬雁等[15]。樣品委托上海聯合基因公司進行雙向測序, 序列測定儀器為3700型Bigdye-Terminator全自動序列分析儀。

1.2.4 DNA序列的數據處理

用BioEdit軟件[16]對測序結果進行編輯, 然后用CLUSTL X軟件[17]對尼羅羅非魚(O.niloticus)與本文所得 5種石斑魚序列進行序列重排和同源比較。手工校正后, 通過PAUP 4.0軟件[18]對序列結果進行統計分析, 分別用最大簡約法(Maximum parsimony method, MP法)和鄰接法(Neighbor-Joining mehtod,NJ法)構建分子系統樹; 通過Pullze軟件[19]用最大似然法(Maximum Likelihood method, ML法)構建分子系統樹。用“Bootstrap” 1000次檢驗各系統樹分支的置信度。用Phylip 5.72軟件[20]中的DNAdist.exe程序分別計算基于 Kimura-2雙參數模型和 Jukes-Cantor單參數模型的遺傳距離。

2 結果

2.1 PCR結果

5種石斑魚樣品(青石斑魚、點帶石斑魚、六帶石斑魚、寶石石斑魚、巨石斑魚)經PCR擴增都分別得到約 800 bp(包括引物)的目的條帶(圖1), 測序獲得的序列于NCBI進行在線比對分析, 證明是rDNA ITS1區序列。

圖1 5種石斑魚樣品rDNA ITS1區序列PCR擴增檢測結果Fig.1 PCR results of rDNA ITS1 regions of 5 kinds of groupers

2.2 序列組成分析和遺傳距離

測出的 5種石斑魚 ITS1區序列長度范圍為805~814 bp, 其中 18S rDNA長度為 214 bp, 5.8S rDNA長度為63 bp, 這兩類rDNA序列在被測的5種石斑魚上完全一致, 產生序列變異的ITS1長度分別為: 青石斑魚536 bp、點帶石斑魚537 bp、六帶石斑魚528 bp、寶石石斑魚532 bp、巨石斑魚535 bp。

所分析的5個石斑魚樣品rDNA ITS1序列的堿基組成比較接近(表2), 整個堿基組成中A+T的含量低于 C+G的含量, 其中, A+T含量最低為寶石石斑魚(37.6%), 最高為六帶石斑魚 41.5%; 單個堿基組成中, A的含量較低, C的含量較高, A含量最低為寶石石斑魚(17.3%), C含量最高為點帶石斑魚和青石斑魚, 均為33%。

表2 5種石斑魚rDNA ITS1序列的堿基組成Tab.2 Base composition of rDNA ITS1 sequences of 5 Kinds of groupers

利用Kimura-2雙參數模型計算的5種石斑魚之間的遺傳距離在 0.0000~0.3002, 其中, 寶石石斑魚與青石斑魚的遺傳距離最大(0.3002), 而點帶石斑魚與青石斑魚的遺傳距離幾乎為 0.0000; 用 Jukes-Cantor單參數模型計算的 5種石斑魚的遺傳距離在0.0000~0.2970, 也是寶石石斑魚與青石斑魚的遺傳距離最大(0.2970), 而點帶石斑魚與青石斑魚的遺傳距離幾乎為0.0000。從表3可以看出2種遺傳模型計算的結果基本一致, 說明這5種石斑魚rDNA ITS1序列的堿基平均轉換數與顛換數之比約為1.5。

表3 基于兩種參數模型5種石斑魚各種間rDNA ITS1序列的遺傳距離Tab.3 Genetic distances of rDNA ITS1 sequences among 5 kinds of groupers based on two parameter models.

2.3 分子系統進化分析

所測定的 5種石斑魚 rDNA ITS1序列經CLUSTL X軟件[12]進行序列重排后, 總位點593個,其中可變位點324個, 信息位點45個, 缺失位點56~65個(圖2)。運用PAUP 4.0軟件以麗魚科(Cichlidae)、羅非魚屬的尼羅羅非魚作外群, 基于 MP法構建rDNA ITS1序列的分子系統樹(圖3)。5種石斑魚逐級聚類: 點帶石斑魚與形態最為相似的青石斑魚首先聚到一起, 然后與形態相似的巨石斑魚和六帶石斑魚分別先后聚到一起, 最后與形態差異稍大的寶石石斑魚聚到一起, 置信度為 76%~100%, 而這 5種石斑魚與外群尼羅羅非魚聚合的置信率不到 5%, 所以在樹上不顯示; 根據上述位點信息, 設定 rDNA ITS1序列不同位點的進化是獨立事件, 生成數據矩陣, 用 ML法, 似然步數為 1000, 構建 rDNA ITS1序列的分子系統樹(圖4), 與依據Kimura 2-parameter model估算遺傳距離, 用NJ法構建的分子系統樹(圖5)分支結構完全一致, 而且這兩種樹與用MP法構建的分子系統樹也一致, 同樣, 外群無法顯示, 說明它與這 5種石斑魚明顯不是一類, 結果是可靠的。MP法、ML法和NJ法構建的3種分子系統樹5種石斑魚聚類結果一致, 充分地反映了 5種石斑魚種間分子系統進化關系。

圖2 排序后的5種石斑魚與外群尼羅羅非魚rDNA ITS1序列(黑體為特征序列或堿基)Fig.2 rDNA ITS1 sequences of 5 species of grouper and the outgroup O.niloticus after alignment(The black words denote the characteristic regions or bases)

圖3 基于rDNA ITS1序列利用MP法構建5種石斑魚的分子系統樹Fig.3 The molecular phylogenetic tree of 5 kinds of groupers based on rDNA ITS1 sequences constructed using MP method

圖4 基于rDNA ITS1序列利用ML法構建5種石斑魚的分子系統樹Fig.4 The molecular phylogenetic tree of 5 kinds of groupers based on rDNA ITS1 sequence constructed using ML method

圖5 基于rDNA ITS1序列利用NJ法構建5種石斑魚的分子系統樹Fig.5 The molecular phylogenetic tree of 5 kinds of groupers based on rDNA ITS1 sequences constructed using NJ method

3 討論與結論

3.1 rDNA ITS區序列特點及5種石斑魚的ITS1序列及其遺傳距離比較

核糖體轉錄間隔區(rDNA ITS)序列是國際上公認的種屬以下的分類、種質鑒別與系統關系分析上是比較穩定和理想的分子遺傳標記[3,21]。ITS區序列包括 ITS1、ITS2, 由于 ITS區序列不加入成熟核糖體, 所以受到的選擇壓力較小, 進化速率較快, 可從較短的序列中獲得較多的系統發育信息, 對魚類種間、亞種和種群水平上的區分鑒定比較實用[22]。已有研究表明ITS1是rDNA中變異較大的區域[23], 在無脊椎動物的系統分類和分子系統進化分析上得到廣泛應用[21,24-26]。在魚類研究方面, 徐暉等[27]在分析6種舌鰨亞科魚類ITS1序列長度多態性及其系統發育分析時發現舌鰨亞科魚類ITS1區具有明顯的長度多態性。孫玉華等[28]在亞口魚科魚類核 DNA 18S-ITS1-5.8 S序列比較分析中也得到了這一結論。郭奕惠等[29]對 5種羅非魚的 ITS1及其兩側的18sRNA和5.8sRNA部分序列特征進行了分析, 結果發現羅非魚ITS1序列多態性較高。Sajdak等[30]利用ITS-1序列構建了較大范圍的白鮭種類的系統發育樹。鐘立強等[31]利用 ITS-1 序列有效的分析了4個鯉魚種群的遺傳變異。盡管ITS1做為分子系統進化具有很多優點, 但在魚類研究相對比較局限。

5種石斑魚ITS1序列的長度在528 bp ~537 bp,點帶石斑魚只比青石斑魚多了一個堿基A, 青石斑魚比巨石斑魚多1個堿基, 是由于青石斑魚存在CAG3個堿基, 巨石斑魚在相應的地方缺失, 巨石斑魚存在TT兩個堿基而青石斑魚相應的地方缺失所造成。六帶石斑魚的 ITS1序列(528bp)和寶石石斑魚的 ITS1序列(532 bp)相對較短, 但可以找到相應的特征性序列以區別于其他種石斑魚。六帶石斑魚的特征性序列為: 5’-ATAATGATGATGATGATGATGT-3’, 22bp;寶石石斑魚的特征性序列為: 5’-TTGCGGCGGGGTCCTCCAACCCCTCCTT-3’, 28 bp。5 種石斑魚這一序列特征可在其遺傳距離上得到反映: 點帶石斑魚與青石斑魚只有 1個堿基的差別, 兩種魚的遺傳距離趨近于0.0000; 巨石斑魚與青石斑魚和點帶石斑魚分別只有1和2個堿基的差別, 與這兩種魚的遺傳距離都只有0.0085。六帶石斑魚與上述3種石斑魚的遺傳距離都小于0.1000, 而寶石石斑魚與其他4種石斑魚的遺傳距離都大于 0.2800。由此可將 5種石斑魚分成3類: 形態與點帶石斑魚很相似的有青石斑魚、巨石斑魚; 形態與點帶石斑魚相似的有六帶石斑魚; 形態與點帶石斑魚有些相似的為寶石石斑魚。對于形態難以區分的種類可用其特征序列進行識別。

3.2 5種石斑魚的分子系統進化關系

依據體色、花紋等形態特征對石斑魚進行分類的難度是從所周知的事實。本研究選擇的 5種石斑魚, 除寶石石斑魚成魚階段可依據形態鑒別外, 其他4種形態均十分相似(表4), 尤其是俗稱“青斑”的3種, 雖序列上可以看出它們的區別, 但苗種生產需要了解石斑魚間的系統關系, 即遺傳背景, 以便為良種選配和遺傳保護提供依據。

表4 5種石斑魚的主要形態特征Tab.4 Major morphological characters of five species of groupers

研究的 5種石斑魚主要分布于太平洋西部和印度洋北部的廣泛海域, 在中國主要分布于南海(表1)。利用MP、ML、NJ 3種方法構建的分子系統樹與遺傳距離和形態分析的結果高度一致, 這說明系統樹聚類的正確性, 同時表明點帶石斑魚在進化上與青石斑魚分化較晚, 而寶石石斑魚在進化上與點帶石斑魚和青石斑魚的分化相對較早。在遺傳育種研究及良種培育生產上, 應避免點帶石斑魚與形態相似的青石斑魚和巨石斑魚間進行交配, 由此導致遺傳多樣性的丟失, 影響物種的生存力。研究的5種石斑魚rDNA ITS1 序列分別與它們的形態呈同步進化的關系, 而在石斑魚 mtDNA Cytb序列的研究發現, mtDNA Cytb序列的進化與形態有些不一致的現象[32-33], 說明mtDNA Cytb序列的進化與rDNA ITS1序列的進化, 可能采取的是兩種不同的進化軌跡。比較而言, rDNA ITS1 序列作為研究石斑魚分子系統進化的遺傳標記, 比mtDNA Cytb序列更為理想, 遺憾的是沒有更多的序列可供比較。但就 5種石斑魚而言, 俗稱“青斑”的3種石斑魚分化時間較晚, 在系統進化上具有高度的一致性, 應避免它們之間的彼此混交, 而這正是我們生產中所要注意到的問題。

[1] Ding S X, Zhuang X, Guo F, et al.Molecular phylogebetic rclationships of China seas groupers based on cytochrome b gene gragment sequences[J].Science in China: (Series C ), 2006, 49(3): 235-242.

[2] 唐伯平, 周開亞, 宋大祥.核 rDNA ITS區序列在無脊椎動物分子系統學研究中的應用[J].動物學雜志,2002, 37(4): 67-73.

[3] 繆煒, 張錫元, 余育和, 等.利用三種分子標記研究緣毛類纖毛蟲的系統發育地位[J].動物學研究, 2003,1: 1-10.

[4] 王薇.蟲草ITS序列分子進化分析及其復合營營養液的體外細胞作用研究[D].成都: 西南交通大學, 2012:94.

[5] 林子杰.三種綠藻的ITS和18SrDNA序列及系統發育分析[D].蘇州: 蘇州大學, 2011: 53.

[6] 王赟, 漆一鳴.兩種眼蚤rDNA ITS1序列的克隆與分析[J].貴州科學, 2011, 4: 29-32.

[7] Pleyte K A, Duncan S D, Phillips R B.Evolutionary relationships of the salmonid fish genus Salvelinus inferred from DNA sequences of the first internal transcribed spacer (ITS 1) of ribosomal DNA[J].Molecular Phylogenetics and Evolution, 1992, 1(3):223-230.

[8] 邱凡, 蘇永全, 傅蒙娜, 等.基于線粒體Cytb和ITS1部分序列分析鯖科魚類分子系統進化關系[J].中國水產科學, 2010, 2: 201-211.

[9] Presa P, Pardo B G, Martínez P, et al.Phylogeographic congruence between mtDNA and rDNA ITS markers in brown trout [J].Mol Biol Evol, 2002, 9: 2161- 2175.

[10] Chow S, Nakagawa T, Suzuki N, et al.Phylogenetic relationships amongThunnusspecies inferred from rDNA ITS1 sequence [J].J Fish Biol, 2006, 68: 24-35.

[11] 張源真, 王偉, 姜志強.基于 ITS-1 序列的部分 鳚 亞目魚類的分子系統進化關系研究[J].現代農業科技,2012, 8: 318-320.

[12] Guo M L, Su Y Q, Zhang Z W, et al.Differentiation ofEpinephelus moarafromE.bruneusby improved nest-tetra-primer-specific PCR[J].Progress in Natural Science, 2009, 19: 1221-1226.

[13] Williams J G K, Kubilik A R, Liavk K J.DNA polymorphism amplified by arbitrary primers is useful as genetic markers[J].Nacl Acids Res, 1990, 18:6531-6535.

[14] Welsh J K.Fingerprinting genoms using PCR with arbitrary primers[J].Nacl Acids Res, 1990, 18:7213-7218.

[15] 金冬雁, 黎孟楓.分子克隆實驗指南(第二版)[M].北京: 科學出版社, 1992: 15-66.

[16] Hall T.BIOEDIT: Biological sequence alignment editor for windows[D].North Carolina, USA: Carolina State University, 1998.

[17] Thompson J D, Gibson T J, Plewniak F, et al.The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J].Nucleic Acids Res, 1997, 25: 4876-4882.

[18] Swofford D L.PAUP: Phylogenetic analysis using parsimony (and other methods), version 4.0[M].Sunderland, Massachusetts: Sinauer Associates, 2001:128.

[19] Strimmer K, von Haeseler A.Quartet puzzling: a quartet maximum-likelihood method for reconstructing tree topologies[J].Mol Biol Evol, 1996, 13: 964-969.

[20] Felsenstein J.Phylogeny inference package (PHYLIP).Version 3.5[R].Washington, Seattle: Department of Genetics, University of Washington, Seattle, 1993.

[21] 繆煒, 余育和, 沈韞芬, 等.6種累枝蟲(Epistylis)rRNA基因18S-ITS1序列及其分子系統發育關系[J].中國科學C輯, 2002, 45(3): 280-288.

[22] 魏曉華.櫛孔扇貝和海灣扇貝的遺傳多樣性研究及扇貝科幾種貝類的分子系統學研究[D].青島: 中國海洋大學, 2004.

[23] Jousson O, Bartoli P, Zaninetti L, et al.Use of the ITS rDNA for elucidation of some life cycles of Mesometridae (Trematoda, Digenea)[J].International Journal for Parasitology, 1988, 28: 1403-1411.

[24] Schilthuizen M, Gittenberger E, Gultyaev A P.Phylogenetic relationships inferred from the sequence and secondary structure of ITS1 rRNA inAlbinariaand putativeIsabellariaspecies (Gastropoda, Pulmonata,Clausiliidae) [J].Mol Phylogenet Evol, 1995, 4(4):457-462.

[25] Lindsay D S, Upton S J, Owens D S, et al.Cryptosporidium andersonin.sp.(Apicomplexa: Crytosporiidae)from Cattle, Bostaurus[J].J Eukaryot Microbiol, 2000,47(1): 91-95.

[26] Dover G A.Molecular drive: a cohesive mode of species evolution[J].Nature, 1982, 299: 111-117.

[27] 徐暉, 李軍, 孔曉喻.等, 6種舌鰨亞科魚類 ITS1序列長度多態性及系統分析[J].海洋與湖沼, 2008,39(1): 35-41.

[28] 孫玉華, 謝從新, 劉思陽.亞口魚科魚類核 DNA 18S-ITS1-5.8S序列比較分析[J].水生生物學報, 2006,3: 367-370.

[29] 郭奕惠, 喻達輝, 黃桂菊, 等.細胞核 rDNA 序列分析 5種羅非魚的親緣關系[J].安徽農業科學, 2009,37(8): 3444-3447.

[30] Sajdak S L, Phillips R B.Phylogenetic relationships amongCoregonusspecies in ferred from the DNA sequence of the first in ternaltranscribed spacer (ITS1)of ribosomal DNA[J].Can J Fish Aquat Sci, 2003, 54(7) : 1494-1503.

[31] 鐘立強, 張成鋒, 周凱, 等.四個鯉魚種群 ITS-1 序列的遺傳變異分析[J].湖泊科學, 2011, 2: 271-276.

[32] 朱世華, 楊迎春, 鄭文娟, 等.從細胞色素 b 部分序列探討石斑魚屬的分子系統發育關系[J].水生生物學報, 2006, 30(4): 432-438.

[33] 陳藝燕, 章群, 任崗, 等.10 種石斑魚系統發育的線粒體細胞色素 b 基因序列分析[J].海洋科學, 2006,30(6): 12-15.