慢性支氣管炎小鼠模型構建方法的改良與評價*

杜秀婷，羅　良，謝宛君，肖志勛，卓桂鋒，蘇　寧(廣州中醫藥大學，廣東廣州510405)

慢性支氣管炎小鼠模型構建方法的改良與評價*

杜秀婷，羅良，謝宛君，肖志勛，卓桂鋒，蘇寧△
(廣州中醫藥大學，廣東廣州510405)

［摘要］目的:結合慢性支氣管炎的發病機制及致病因素，在以往單因素致病建模方法的基礎上進行改良，探究一種較為準確、可靠、符合慢性支氣管炎病理變化的模型。方法:慢支改良組(復合組)小鼠于實驗第1、14天分別經氣管和經鼻腔注入LPS，同時，于第2～30天(第14天除外)進行被動吸煙及SO2吸入; SO2組小鼠每天熏SO22 min;煙熏組小鼠每天吸煙4支/次，直至1包煙燃燒完畢，共約1 h;脂多糖組小鼠在造模第1天氣管注入LPS，第14天、30天進行LPS滴鼻。各模型組均連續造模30 d。造模結束后通過對小鼠一般情況的觀察、肺泡灌洗液結果分析以及支氣管肺組織形態學觀察等評價改良后的慢支模型。結果:造模后各模型組小鼠出現鼻部潮濕，咳嗽，體毛干枯無光澤，拱背蜷縮，少動，反應較為遲鈍等癥狀，復合組的體質量增長最慢。從各組模型組病理切片可觀察到細支氣管壁周圍有炎性細胞浸潤，腔內炎性滲出明顯，氣道內分泌物增多等病變;與煙熏組、二氧化硫組比較，慢支改良組肺泡灌洗液白細胞總數顯著增高(P＜0.01) ;慢支改良組與其它3組比較肺組織炎癥細胞浸潤程度顯著升高(P＜0.01)，且煙熏組與LPS組比較差異有統計學意義。結論:煙熏、二氧化硫、LPS均可導致小鼠慢支疾病的發生，而從支氣管及肺組織病理學、肺泡灌洗液細胞學以及慢支的發病學等方面分析，復合因素造模更為符合慢支模型的構建。

［關鍵詞］慢性支氣管炎;煙熏;二氧化硫;脂多糖

慢性支氣管炎(慢支)是由于感染、理化因素等長期刺激而引起的氣管、支氣管黏膜及其周圍組織的慢性非特異性炎癥。臨床上以咳嗽、咯痰或伴有喘息為主要癥狀［1］。慢支加速肺功能的下降，且病情日益惡化，降低了患者的生活質量［2］。其經常反復發作可并發慢性阻塞性肺氣腫、慢性肺源性心臟病等疾病。目前對慢支的防治研究已受到國內外醫學研究者的關注。對于慢支的基礎研究，往往離不開慢支模型的成功復制。Kodavanti等［3］利用二氧化硫建立動物氣道炎癥模型，Vlahos等［4］利用煙熏法建立小鼠肺部炎癥模型，近年來較為常用的是煙熏聯合脂多糖法。慢性支氣管炎由于病因復雜，臨床癥狀多樣，病程反復遷延，給動物模型的合理模擬及觀測指標的客觀、精確與量化帶來很大難度，研究進展甚緩，多數研究仍停留于應用傳統經典方法，近年來雖有新的探索，但實用者甚少［5］。而到目前為止，國內外仍未有一套標準化的慢支造模方式，各種造模方法良莠不齊，慢支模型的復制質量仍是慢支基礎研究的一大障礙。為探究一種切實可行、復制成功率高的慢支模型建造方法，本實驗通過總結近幾年來國內外的慢支造模方式，結合慢性支氣管炎的發病機制及致病因素，在以往單因素致病建模方法的基礎上進行改良，設計出脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)+煙熏-二氧化硫(sulfur dioxide，SO2)吸入交替法建造慢性支氣管炎動物模型。

材料和方法

1材料

1.1動物健康4周齡昆明小鼠32只，雌雄不限，體質量(20±4) g，由廣州中醫藥大學動物中心提供，許可證號為SCXK(粵) 2013-0020。

1.2煙熏材料芙蓉牌香煙(焦油量11 mg，煙氣煙堿量0.9 mg，煙氣一氧化碳量13 mg)購自湖南中煙工業有限責任公司。

1.3主要試劑與儀器Leica TP1020脫水機、Leica EG1600包埋機、Leica RM 2135輪轉式切片機、Leica ST4040染色機、Olympus生物顯微鏡均由廣州中醫藥大學西醫基礎實驗室提供;水合氯醛、靜脈導管針套管、LPS購自Sigma;自制密閉煙熏箱;無水亞硫酸鈉、磷酸鹽緩沖液、甲醛溶液均為國產分析純。

2實驗方法

2.1動物分組健康4周齡昆明種小鼠32只，按隨機數字表法分為4組，分別為復合組(脂多糖+煙熏-SO2吸入交替法)、SO2組(SO2吸入法)、煙熏組(煙熏法)、脂多糖組(脂多糖法)，每組8只。

2.2建造模型復合組小鼠:于實驗第1天用5%劑量為0.1 mL/10 g的水合氯醛［6］麻醉后，仰臥、固定，剪開頸部皮膚，分離氣管，用微量進樣器快速注入濃度為1 g/L的LPS 50 μg［7］，第14天按上述劑量麻醉后，用濃度為1 g/L的LPS滴鼻;同時，于第2～30天(第14天除外)在自制密閉煙熏箱(50 cm×50 cm×30 cm)內交替進行被動吸煙及SO2吸入;吸煙4支/次，直至1包煙燃燒完畢，每天共約1 h; SO2吸入則取無水亞硫酸鈉0.4 g盛于小燒杯置于干燥瓶(7 L)中，加入30%硫酸0.4 mL反應產生SO2氣體，將8只改良組小鼠分2次放入干燥瓶各熏2 min，每只小鼠每天熏1次。SO2組:取無水亞硫酸鈉0.4 g盛于小燒杯置于干燥瓶(7 L)中，加入30%硫酸0.4 mL反應產生SO2氣體，將SO2組小鼠(8只)分2次放入干燥瓶中各熏2 min，每天1次，連續30 d。煙熏組小鼠置于自制密閉煙熏箱(50 cm×40 cm×30 cm)內交替進行被動吸煙;吸煙4支/次，直至1包煙燃燒完畢，共約1 h，造模30 d。脂多糖組小鼠(8 只)在第1天用5%劑量為0.1 mL/10g的水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于操作臺，剪開頸部皮膚，分離氣管，用微量進樣器快速注入濃度為1 g/L 的LPS 50 μg;第14天、30天按上述劑量麻醉后，用濃度為1 g/L的LPS滴鼻，共造模30 d。

2.3一般情況的觀察觀測小鼠的活動度、對外界反應的靈敏度、皮毛光澤、飲食、飲水、死亡情況。造模前、造模1月后，取標本前稱重，觀察體重的變化。慢支模型組小鼠有明顯的咳嗽、鼻部潮濕，食少，體毛干枯無光澤，拱背蜷睡，少動，反應遲鈍，食少，體重下降等表現［8］。

2.4支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)分析用5%劑量為0.1 mL/10 g的水合氯醛麻醉小鼠，氣管前方切開皮膚，鈍性分離暴露氣管，使用磷酸鹽緩沖液1.5 mL行支氣管肺泡灌洗(分3次，每次0.5 mL)，回收肺泡灌洗液共約1 mL，4℃離心10 min，1 500 r/min，回收上清液－20℃保存，用1 mL含有1% BSA的PBS重懸細胞沉淀，取10 μL重懸液于血細胞計數板中進行白細胞計數。

2.5支氣管肺組織形態學觀察取左肺于10%的甲醛溶液中固定，乙醇梯度脫水，二甲苯透明標本，浸蠟、包埋、切片、HE染色。于光學顯微鏡下觀察組織形態學改變。

2.6炎癥細胞計數取每個樣本切片置于400倍的光學顯微鏡下觀察，隨機抽取5個視野，使用Image-Pro Plus 6.0軟件手動進行細胞計數。

3統計學處理

實驗數據以均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 17.0統計分析軟件行單因素方差(one-way ANOVA)分析，2組間比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

Figure 1.The mice were induced by different methods for modeling of chronic bronchitis.A: in the smoking process (smoking group)，the mice were restless and tachypneic in the first half hour; B: in the smoking process (smoking group)，the mice were slow down in response in the other half hour; C: in the SO2group，the mice had experienced symptoms including wet nose，cough，moist hair，dysphoria，dyspnea，etc; D: after intratracheal instillation of LPS (LPS group)，the mice were under anaesthetic.圖1小鼠受不同方法誘導建立慢性支氣管炎病理模型的大體表現

結果

1小鼠慢支模型的一般狀況觀察

造模前，小鼠活動度正常，對外界反應靈敏，皮毛有光澤，飲食、飲水均正常，體重為20～25 g。造模過程中，煙熏組小鼠在煙熏過程的前半小時躁動不安，跳動，呼吸急促;后半小時全身濕潤，鼻部潮濕，呼吸急促，少動，反應遲鈍。二氧化硫組小鼠躁動，攀爬，呼吸急促困難，口張開，皮毛濕潤。LPS組小鼠第1次氣管內注入LPS，其后2次均滴鼻注入LPS，麻醉過程中活動度減少，逐漸昏迷，滴鼻后全部蘇醒。復合組上述表現較為明顯，外形較顯出消瘦。造模后各模型組小鼠出現鼻部潮濕，咳嗽，體毛干枯無光澤，拱背蜷縮，少動，反應較為遲鈍等癥狀，見圖1。

2支氣管肺組織形態學觀察

各組小鼠肺組織均有不同程度的滲出、水腫、出血，支氣管周圍可見炎癥細胞浸潤，黏膜上皮細胞脫落，管腔內有少量分泌物和炎癥細胞，肺泡間隔增寬，內有炎細胞浸潤及毛細血管擴張、充血，部分肺泡壁變薄、斷裂，肺泡過度擴大融合，肺泡數減少，呈肺氣腫病變，部分肺泡腔內可見滲出物、紅細胞。其中煙熏組細支氣管管腔內分泌物增多，肺泡形態破壞情況較輕;二氧化硫組肺泡形態破壞較為嚴重，大量肺泡壁變薄、斷裂，融合成肺大泡，正常肺泡數明顯減少;脂多糖組黏膜上皮損傷較嚴重，肺泡腔內可見炎性細胞;復合組氣管周圍有炎性細胞浸潤、管腔內滲出物增多，見圖2。

3支氣管肺泡灌洗液分析結果

由不同造模方式建造的4組慢支模型的小鼠均出現不同程度的慢支病變。小鼠造模后進行肺泡灌洗液白細胞計數，各組結果如表1所示。與煙熏組比較，其它3組肺泡灌洗液的白細胞總數增高，差異顯著(P＜0.05) ;與二氧化硫組比較，LPS組和復合組肺泡灌洗液的白細胞總數增高(P＜0.05) ;與LPS組比較，復合組肺泡灌洗液的白細胞總數增高，但差異不顯著。說明不同的單因素刺激對小鼠慢支的形成存在一定的差異，而復合因素造模后使肺泡灌洗液的白細胞總數增高最為明顯。

4病理切片炎癥細胞計數結果

運用4種不同造模方式造模后，與煙熏組比較，其它3組小鼠肺組織炎癥細胞數均有增高，其中LPS組與復合組具有顯著差異(P＜0.05) ;與二氧化硫組比較，復合組肺組織炎癥細胞數增高(P＜0.01) ;與LPS組比較，復合組肺組織炎癥細胞數增高，具有顯著差異(P＜0.01)。說明不同造模方式可促進小鼠支氣管、肺泡、肺泡間隔、血管等肺部結構的炎癥細胞浸潤，其中復合因素刺激作用更為明顯，見表1。

討論

吸煙所致煙霧對呼吸道的長期刺激是慢性支氣管炎最重要的病因。紙煙所含的焦油和菸堿可增加副交感神經興奮性，使支氣管收縮痙攣，增加氣道阻力;同時，支氣管黏膜腺體增生與肥大，杯狀細胞增生與鱗狀上皮細胞化生，黏膜分泌增多與積聚，上皮細胞纖毛運動受抑制;黏膜充血、水腫，肺泡吞噬細胞功能降低，使氣道凈化能力減弱，均易引起感染。吸煙時間愈長，煙量愈大，患病率也愈高。吸煙者的患病率比不吸煙者高約2～8倍。戒煙后可緩解病情，使癥狀減輕或消失。煙熏法可成功復制慢性支氣管炎動物模型。吸入刺激性氣體SO2，復制慢性支氣管炎，能可靠地引起慢性支氣管炎病理變化和氣流阻塞。脂多糖是革蘭陰性菌的外膜結構，也是重要的致炎因子，可直接引起氣道上皮損傷，導致各種炎癥細胞激活和細胞因子的釋放，誘發氣道炎癥［9］。大鼠氣管內滴注脂多糖1 mg/kg可復制急性肺損傷模型，出現富含蛋白、纖維蛋白的肺泡分泌液和彌漫性嗜中性細胞肺泡炎。大鼠氣管內滴注胰彈性蛋白酶和人嗜中性細胞彈性蛋白酶引起可逆性支氣管上皮黏液細胞化生［10］。因此，根據慢支的病因病機和病理變化，慢支模型常來源于肺炎克雷伯桿菌和肺炎鏈球菌、脂多糖、香煙煙霧、刺激氣體等致病因素。

Figure 2.The biopsy of the lung tissues in the mice with different chronic bronchitis modeling methods (HE staining).圖2不同方法誘導慢性支氣管炎小鼠模型的支氣管肺組織形態學觀察

表1　不同造模方法對小鼠肺泡灌洗液白細胞和肺組織炎癥細胞的影響Table 1.The effects of 4 modeling methods on the leukocyte count in BALF and inflammatory cells number in the lung tissue of the mice (Mean±SD.n=8)

現代醫學對痰多、黏稠主要從氣道黏液高分泌的角度研究。慢支、COPD的發生發展過程中，由于感染、變應原、刺激性氣體和煙霧等有害因素的作用，使炎性細胞和氣道黏膜、黏膜下細胞受損而釋放多種炎性介質，刺激氣道上皮杯狀細胞增生、化生及黏膜下腺體增生肥大，導致氣道分泌亢進，表現為黏液的量和黏稠度明顯增高［11］。氣道炎癥是慢支病理機制中的一個關鍵環節［12］。煙草中含有多種有害成分如焦油、尼古丁、一氧化碳和各種粉塵顆粒［13］。長期吸煙可引發慢性支氣管炎、肺氣腫及慢性阻塞性肺疾病等肺損害［14-15］。因此，吸煙是慢支形成的一個重要的致病因素;脂多糖存在于革蘭陰性菌的細胞外壁，主要由類脂質和多糖構成，在環境中普遍存在。研究表明，慢支并非全部由吸煙引起的，其它一些環境暴露或職業性暴露也是慢支的重要致病因素，而這些環境或職業性暴露如有機粉塵等的微生物成分就含內毒素。另外，刺激性煙霧、有害氣體如SO2，對支氣管黏膜造成損傷，造成支氣管杯狀細胞增生，黏膜分泌增加，為細菌侵入創造條件。

慢性支氣管炎可能是多種因素長期相互作用的結果。根據導致慢支發生的感染、刺激性氣體、吸煙等致病因素，本實驗通過煙熏、二氧化硫、LPS以及復合法建造4組慢支模型，從小鼠的臨床癥狀，體征以及病理分析、肺泡灌洗液白細胞總數增加、肺組織炎癥細胞浸潤量增高等說明成功建立小鼠慢性支氣管炎模型，其中復合組的體質量增長幅度較小，肺泡灌洗液白細胞總數和炎癥細胞數目增長幅度較大，以及結合慢支致病因素的多元化表明復合因素刺激更為符合慢支模型的構建。

復合致病因素改良法和以往的吸煙與脂多糖聯合法相比，其特點是增加了以二氧化硫為代表的空氣污染致病因素，體現了在慢支發生過程中，空氣中的刺激性煙霧和有害氣體如二氧化硫的危害性，更有力地說明慢支是由多種因素長期作用的結果，提示在臨床上避免吸煙、空氣污染、感染等慢支主要致病因素的侵襲將有利于降低慢性支氣管炎的發病率，進一步揭示了人類日常生活中多因素致病的現實情況。

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(責任編輯:林白霜，余小慧)

Improvement and evaluation of chronic bronchitis modeling methods in mice

DU Xiu-ting，LUO Liang，XIE Wan-jun，XIAO Zhi-xun，ZHUO Gui-feng，SU Ning
(Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China.E-mail: d1121352956@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To explore a more accurate and reliable pathological model of the chronic bronchitis，which has improved from the former single-factor modeling method of the disease.METHODS: The mice in complex group were treated with lipopolysaccharide (LPS) by tracheal injection on the 1st day and nasal drops on the 14th day，and from the 2nd day to 30th day，the animals were given passive smoking and sulfur dioxide (SO2) inhalation (except on the 14th day).The mice in SO2group were exposed to SO22 min per day，while in smoking group，the mice were exposed to smoke for about 1 h per day (4 cigarettes each time until one pack of cigarettes were burning up).In LPS group，the mice had tracheal injection of LPS on the 1st day and nasal drops of LPS on the 14th day and 30th day.Every modeling process lasted for 30 days.After modeling，the improvement of chronic bronchitis model was evaluated by testing the general conditions of the mice，analyzing leukocyte count in bronchoalveolar lavage fluid (BALF)，and observing the morphological changes of the bronchial and lung tissues.RESULTS: After modeling，the mice in every model group experienced symptoms including wet nose，cough，dry and lusterless hair，arched back and curled-up body，showing inactive，and slow down in response.The mice in complex group gained the lowest weight compared to other groups.From each model group，the inflammatory cells infiltrated evidently around the bronchial walls，especially in the bronchial cavity，and the mucilage secretion in the airway increased.The total number of leukocytes in BALF increased significantly in complex group.The inflammatory cell count in the lung tissue indicated that the mice in complex group had significantly higher levels of inflammatory cell infiltration.Besides，the comparison between smoke group and LPS group was statistically significant.CONCLUSION: Smoking，SO2inhalation and LPS injection induce bronchial lung disease in mice，and the complex chronic bronchitis mouse model is a better model with the pathological changes of bronchus，lung tissue and BALF，and pathogenesis of chronic bronchitis.

［KEY WORDS］Chronic bronchitis; Smoking; Sulfur dioxide; Lipopolysaccharide

通訊作者△Tel: 020-39358038; E-mail: d1121352956@163.com

*［基金項目］廣東省大學生創新實驗項目(No.1057213013)

［收稿日期］2015-04-20［修回日期］2015-05-29

［文章編號］1000-4718(2015)09-1724-05

［中圖分類號］R363

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.035