嵌合體真核表達質粒pVAX1- SPG的構建及表達研究

王怡丹, 孫天瞳, 劉建國,3, 柴巧學, 曲云鵬, 于曉光, 白國輝,3, 田 源,3, 韓 琪

(貴州 遵義: 1. 遵義市第一人民醫院口腔科, 563002; 2. 遵義醫學院口腔醫學院口腔內科學教研室, 563099;3. 貴州省高等學?？谇患膊⊙芯刻厣攸c實驗室 遵義市口腔疾病研究重點實驗室, 563099)

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嵌合體真核表達質粒pVAX1- SPG的構建及表達研究

王怡丹1,3, 孫天瞳2, 劉建國2,3, 柴巧學2, 曲云鵬2, 于曉光2, 白國輝2,3, 田 源2,3, 韓 琪2

(貴州 遵義: 1. 遵義市第一人民醫院口腔科, 563002; 2. 遵義醫學院口腔醫學院口腔內科學教研室, 563099;3. 貴州省高等學?？谇患膊⊙芯刻厣攸c實驗室 遵義市口腔疾病研究重點實驗室, 563099)

目的: 構建含變異鏈球菌表面蛋白SpaP的P區編碼基因spap- P和葡聚糖結合蛋白GbpA的葡聚糖結合區編碼基因gbd的嵌合體真核表達質粒pVAX1- SPG，并觀察其在哺乳動物細胞293T中的表達。方法：通過基因工程技術構建嵌合體真核表達質粒pVAX1- SPG，并采用脂質體轉染法將其轉染至293T細胞中；然后分別采用免疫組化SABC法和Western- blot檢測嵌合蛋白SpaP/P- GBD在真核細胞中的表達。結果：重組真核表達質粒pVAX1- SPG經酶切、測序鑒定證實，其所攜帶的外源基因片段為2.4 kb的目的基因片段，序列同源性為99%；免疫組化染色結果顯示，經pVAX1- SPG轉染的293T細胞胞質呈棕褐色染色；Western- blot檢測結果顯示，分子量為72 kDa的嵌合蛋白SpaP/P- GBD能夠被正確表達。結論： 構建成功的嵌合體真核表達質粒pVAX1- SPG能在真核細胞293T中正確表達目的蛋白。

變異鏈球菌; 表面蛋白抗原; 葡聚糖結合蛋白; 哺乳動物細胞; 真核表達

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(11):645]

齲病是口腔的常見病和多發病，其主要致病菌為變異鏈球菌。變異鏈球菌的主要致齲作用是其對牙面的粘附、聚集、產酸和耐酸。表面蛋白(surfaceprotein antigen，SpaP)又被不同學者命名為PAc、P1和AgI/Ⅱ 等，是變異鏈球菌的主要粘附素(adhesins)。有研究表明，SpaP在介導變異鏈球菌對牙面的蔗糖非依賴性粘附中起著關鍵作用，被視為變異鏈球菌族細菌的主要毒力因子之一[1]。葡聚糖結合蛋白(glucan bind protein，Gbp)是變異鏈球菌菌細胞表面的葡聚糖結合受體，其在變異鏈球菌參與的蔗糖依賴性粘附中起著關鍵的作用。目前已有4種不同的Gbp被相繼發現，分別為GbpA、GbpB、GbpC和GbpD。GbpA的葡聚糖結合區(glucan- binding domain，GBD)被認為是介導變異鏈球菌粘附的重要功能區，與牙菌斑生物膜的形成關系密切[2]。本研究擬構建含變異鏈球菌表面蛋白SpaP的功能區P區編碼基因spap- P和葡聚糖結合蛋白GbpA的功能區葡聚糖結合區編碼基因gbd的嵌合體真核表達質粒pVAX1- SPG，并觀察其在真核細胞293T中的表達，以期為下一步嵌合體基因防齲疫苗pVAX1- SPG的動物實驗研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

PrimeSTAR? HS DNA Polymerase高保真DNA聚合酶、In- Fusion Advantage PCR Cloning Kit連接試劑盒、DNA分子量Marker λ- Hind Ⅲdigest、DNA分子量Marker DL2000(大連寶生物公司)；質粒pVAX1和lipofectamine 2000(Invitrogen, 美國)；GoldViewTM核酸染料(北京賽百盛)；DMEM培養基(Sigma, 美國)；胎牛血清(Hyclone，美國)；SABC試劑盒(武漢博士德)；質粒提取試劑盒(北京TIANGEN)；抗SpaP的IgG抗體和抗GBD的 IgG抗體(本課題組前期制備)；生物素標記的羊抗兔IgG(Amresco，美國)。

1.1.2 質粒及細胞株

含基因spap- P和gbd的重組質粒pVAX1-SpaP/P、pVAX1- GbpA/GBD(本課題組前期構建)[3-4];大腸桿菌JM109(中科院成都生物所馬欣榮博士惠贈);293T細胞(中科院上海細胞所)。

1.2 方法

1.2.1 目的質?？寺?/p>

分別取重組質粒pVAX1- SpaP/P、pVAX1- GbpA/GBD，經高頻轉化法轉化至大腸桿菌的JM109細胞后，采用質粒提取試劑盒提取質粒，并進行雙酶切鑒定。

1.2.2 目的片段的擴增

1.2.2.1 引物設計

根據GenBank中報道的spap- P和gbd序列設計引物，并交大連寶生物公司進行引物合成(表1)。

表1 PCR引物序列

在spap-P上游引物中引入Kpn I酶切位點GGTACC和Kosak序列ACCACCACCATG，在spap-P下游引物的互補序列和gbd上游引物上設計相同的15個堿基序列GATAATCCAAGAGAA，在gbd下游引物增加EcoR I的酶切位點GAATTC和終止密碼子TAG。

1.2.2.2 PCR 擴增目的片段

PCR 反應體系共50 mL，分別為：質粒pVAX1-SpaP/P、pVAX1- GbpA/GBD各0.5 μL，spap- P或gbd上游引物(20 pmol/μL)0.5 μL，spap- P或gbd下游引物(20 pmol/μL)0.5 μL，dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)4 μL，5×PrimeSTAR Buffer(Mg2-plus)10 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5 U/μL)0.5 μL，ddH2O 33.5 μL。反應條件為(98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 2 min)×30循環，72 ℃延伸10 min。

1.2.3 重組質粒pVAX1- SPG的構建及鑒定

嚴格按相關試劑盒操作說明純化回收PCR產物，并用內切酶Kpn I和EcoR I 對載體pVAX1進行酶切和回收。然后用In- Fusion Advantage PCR Cloning連接試劑盒對上述酶切回收的產物進行連接，連接體系共10 μL, 分別為：PCR擴增產物spap- P 1μL，PCR擴增產物gbd 1μL，載體質粒pVAX1 1μL，5×In- Fusion Reaction Buffer 2μL，In- Fusion Enzyme 1μL，ddH2O 4 μL。連接條件為37 ℃ 15 min，50 ℃ 15 min。上述連接完成后，取1 μL連接產物轉化JM109感受態細胞。并將轉化后的JM109 涂布于含20 μg/mL 卡那霉素的LB抗性篩選平板上，置于37 ℃條件下進行培養。培養16 h后挑取單個菌落，再置于37 ℃條件下振蕩培養過夜，并進行質粒提取。所提取的質粒通過Kpn I 和EcoR I 雙酶切進行鑒定后，即得到與目的基因大小相符的條帶，然后將其送寶生物技術公司進行測序鑒定。

1.2.4 重組質粒pVAX1- SPG的表達鑒定

1.2.4.1 脂質體介導pVAX1- SPG瞬時轉染293T細胞

取293T細胞常規復蘇培養后，用DMEM制成密度1.0×105/mL的細胞懸液，并將其接種于6孔培養板內預先放置的載玻片上(每孔2 mL)；常規條件下培養至24 h細胞匯合達80%進入對數生長期時，利用 lipofectamine 2000 分別將8 μg重組質粒pVAX1- SPG和8 μg pVAX1空載體質粒轉染至實驗組和對照組293T細胞中。所有操作均嚴格按SABC試劑盒說明。

1.2.4.2 免疫組化染色觀察重組質粒pVAX1-SPG在細胞內的表達

細胞轉染48 h后，采用免疫組化SABC法檢測重組質粒pVAX1- SPG在293T細胞內的表達情況。具體方法如下：分別取實驗組和對照組細胞爬片，用40 g/L多聚甲醛固定后，PBS漂洗5 min×3次；滴加30 mL/L過氧化氫液室溫孵育10 min；PBS漂洗5 min×3次，滴加50 g/L BSA封閉液37 ℃ 封閉30 min；PBS漂洗5 min×3次，滴加抗SpaP或抗GBD的 IgG抗體(1 ∶150)4 ℃孵育過夜；37 ℃復溫30 min后PBS漂洗5 min×3次，滴加羊抗兔IgG抗體，37 ℃孵育30 min；PBS漂洗5 min×3次，滴加SABC復合物37 ℃孵育30 min；PBS漂洗5 min×3次，DAB顯色、蘇木素復染；梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察染色結果并拍照。

1.2.4.3 Western- blot檢測嵌合蛋白SpaP/P-GBD在細胞中的表達

轉染48 h后，分別離心收集實驗組和對照組的293T細胞，并經蛋白裂解液裂解后提取其總蛋白。所提取的蛋白樣品經120 g/L的SDS- PAGE 膠進行分離后，轉移至NC 膜上，并用含100 g/L BSA 的PBS進行封閉；然后再分別用稀釋的一抗和酶標記的IgG二抗進行免疫標記。標記結束后，滴加ECL發光試劑進行激發，并用凝膠成像系統進行檢測。同時取實驗組細胞總蛋白的SDS- PAGE 膠進行考馬斯亮藍染色觀察。

2 結果

2.1 重組質粒pVAX1- SpaP/P、pVAX1- GbpA/GBD的酶切鑒定

本課題組前期構建的重組質粒pVAX1- SpaP/P經EcoR I和BamH I雙酶切后，可得到大小約3.0 kb 和1.2 kb的片段(圖1)；pVAX1- GbpA/GBD經EcoR I和Xba I雙酶切后，亦可得到大小約3.0 kb和1.2 kb的片段(圖2)，均與目的片段大小相符。

圖1 pVAX1-SpaP/P酶切產物 圖2 pVAX1-GbpA/GBD酶切產物

2.2 PCR擴增產物膠回收電泳結果

以重組質粒pVAX1- SpaP/P、pVAX1- GbpA/GBD為模板進行PCR擴增后，分別擴增出了1.2 kb的spap- P片段和1.2 kb的gbd片段，其分子量均與預計的大小相同(圖3)。

2.3 重組質粒pVAX1- SPG的酶切鑒定和測序分析

重組質粒pVAX1- SPG經Kpn I和EcoR I雙酶切后，可得到大小約3.0 kb和2.4 kb大小的片段(圖4)；委托寶生物工程公司使用T7、BGHrev進行測序分析，該序列核苷酸同源性與Genbank數據庫中同源性達到99%，表明目的基因順利嵌合到載體pVAX1中，成功構建出重組真核表達質粒pVAX1- SPG。

圖3 目的基因spap-P,gbd PCR結果 圖4 pVAX1-SPG酶切產物

2.4 重組質粒pVAX1- SPG在真核細胞中的表達鑒定

2.4.1 免疫染色結果

SABC法瞬時轉染293T細胞48 h免疫組化染色結果顯示，重組質粒pVAX1- SPG轉染的細胞胞質中呈棕褐色染色； pVAX1空載體質粒轉染的細胞胞質無著色(圖5～6)。提示，將pVAX1- SPG轉染入293T細胞后，在細胞內表達的蛋白能夠與抗體特異性結合，具有抗原性。

圖5 空載體質粒pVAX1轉染的293T細胞免疫組化結果(×400) 圖6 重組質粒pVAX1-SPG轉染的293T細胞免疫組化結果(×400)

2.4.2 Western- blot檢測結果

轉染48 h后，分別提取實驗組和對照組細胞總蛋白進行Western- blotting分析顯示，轉染pVAX1- SPG的實驗組中，其表達產物嵌合蛋白SpaP/P- GBD能與SpaP和GBD發生對應的抗體反應，在72 kDa處可見陽性條帶；而轉染空載體pVAX1的對照組中未出現特異性條帶(圖7)。以上結果說明，表達的外源蛋白具有免疫活性結構，構建的質粒pVAX1- SPG可以在293T細胞中成功表達。

圖7 細胞總蛋白的考馬斯亮藍染色和表達產物的Western- blot分析

3 討論

變異鏈球菌是目前公認的重要致齲菌之一，其表面抗原SpaP可介導其對牙面的非蔗糖依賴性粘附，是目前研究較多的毒力因子。變異鏈球菌表面蛋白SpaP蛋白分子中間存在2～3個由39個氨基酸殘基組成的串聯重復序列，該序列富含脯氨酸，呈伸展狀態的β片層結構，同時還富含T、B細胞表位，稱之為P區。P區能夠誘發機體的免疫應答，是理想的防齲疫苗基因選擇區。

變異鏈球菌能合成多種胞外多糖，其中Gbp在變異鏈球菌參與的蔗糖依賴性口腔菌斑生物膜形成中起著關鍵的作用。多數研究表明，GbpA的GBD是介導變異鏈球菌粘附的重要功能區，有較好的免疫原性。吳補領等[5]報道，將GbpA的GBD蛋白經皮下注射免疫SD大鼠后，能夠誘導抗GBD抗體的產生。蘇凌云等報道[6]，將構建的真核表達質粒pcDNA3.1- GBD經頜下腺區注射免疫SD大鼠后，可使 SD大鼠的齲病發生率和患齲程度明顯降低。

嵌合體防齲疫苗是利用基因工程技術將兩種或兩種以上的基因或其功能片斷連接起來，并通過直接免疫機體或通過轉化大腸桿菌、植物等宿主后，再經誘導使其表達，以獲取具有抗原成分的融合蛋白；然后再用該蛋白免疫機體，即可誘導機體產生針對抗原的保護性免疫。這兩個或多個基因可以是具有協同效用的抗原基因或片斷，也可以是抗原基因和免疫佐劑的編碼基因，均可通過連接而增強疫苗的效能[7-8]。目前嵌合體防齲疫苗常用的候選基因主要有：①變異鏈球菌族細菌表面蛋白及其功能區編碼基因，雖然表面蛋白的命名有所不同，但其核苷酸序列和蛋白序列具有高度的同源性，且具有較好的免疫原性[7]；有學者通過將變異鏈球菌表面蛋白PAc的A區、P區及葡糖基轉移酶GTF- I的編碼葡聚糖結合區GLU的基因序列克隆到真核載體pCI后，構建了嵌合表達載體pGLUA- P，并證實該重組質粒能夠在原核、真核細胞中表達正確的GLU- A- P融合蛋白[9-10]; ②葡糖基轉移酶及其功能區編碼基因，有研究表明，葡糖基轉移酶GTF- I的催化活性區CAT的抗體能抑制變異鏈球菌合成水溶性和水不溶性葡聚糖；葡聚糖結合區GLu含有重要的抗原決定簇，能抑制GTF- I的作用[3,11]。孫靜華[12-13]和Niu[14]等研制了包含表兄鏈球菌OMZl76GTF—I的CAT區和變異鏈球菌PAc、GLU基因序列的復合防齲DNA疫苗，將重組質粒及對照質粒分別經股四頭肌注射和鼻腔滴注免疫BALB/c小鼠后發現，實驗組小鼠的血清和唾液中的抗PAc、抗GLU、抗CAT抗體水平均顯著高于空載體對照組。

嵌合體防齲疫苗常用的免疫佐劑主要有：霍亂毒素(cholera toxin，CT)及其亞單位CTB、不耐熱腸毒素(heat- labile enterotoxin, LT) 及其B亞單位 (LTB)和CpG免疫刺激序列、一些細胞因子和沙門氏菌鞭毛蛋白等；這些佐劑均能有效提高抗原的免疫原性，且可降低免疫耐受的發生[15-16]，其編碼基因不僅能通過與抗原基因連接而表達融合蛋白，同時還能表達兼具兩者活性的產物。楊小青等[17]對編碼PAcA的DNA片段進行擴增后，通過T- A克隆技術將目的DNA 片段克隆于載體pMD18- T，并進一步亞克隆于含有CpG免疫刺激序列的真核表達載體pcDNA3.1中，從而成功構建了含有免疫刺激序列且可防止變異鏈球菌在牙面粘附的DNA疫苗pcDNA3.1- PAcA。Shi等[18]將鞭毛素蛋白佐劑和抗原PAc融合成功構建了一個既包含黏膜佐劑又包含疫苗目標抗原的重組蛋白，進一步研究發現，用該蛋白經鼻腔黏膜免疫可誘導產生高效的特異抗體應答，尤其是口腔特異IgA抗體應答。

防齲疫苗的研究已有70余年的歷史。我國在防齲基因疫苗領域的研究已處于國際先進水平，且已研制出了針對變異鏈球菌單個或多個毒力因子的基因疫苗，并經動物實驗證實均有較好的防齲效果，其中以針對兩種毒力因子的嵌合體基因疫苗的保護作用更好[19-20]。盡管如此，嵌合體防齲基因疫苗的研究仍存在以下一些問題[7-8]：①不同的變異鏈球菌粘附素有所不同，與之反應的配體也不同(不同的配體在蛋白分子中會有相應的粘結位點)，當粘附素與不同狀態的配體結合時，會產生不同的生物學意義(與附著在固相表面的配體結合會促進變異鏈球菌在牙齒表面的粘附，而與液相配體結合則會促進變異鏈球菌凝集，有利于對致齲菌的非免疫性清除)；②基因重組多肽的表達宿主、純化方式不同，會導致其生物學性能的改變。③以融合蛋白形式制備的多肽在空間結構和生物學特性上可能會受到相互之間不同程度的影響，這也是不同研究者用同一抗原的相同免疫活性區段進行多肽研究時，所得到的結論不同甚至完全相反的原因之一；④多肽粘附能力可能與其鏈的長度有關，過短的肽鏈因不能提供充足的結合位點，往往觀察不到粘附作用；⑤蛋白、酶等抗原分子的二級結構和三級結構仍不確定，通過基因工程技術制備的用于粘附相關研究的基因工程多肽的空間結構與其蛋白的天然分子立體結構存在一定差異，而且這些多肽的結構也不甚清楚。

本研究通過將變異鏈球菌的兩個重要毒力因子SpaP的P區編碼基因spap- P和GbpA的GBD編碼基因gbd進行嵌合，構建了嵌合體真核表達質粒pVAX1- SPG；經相關實驗并證實，該重組質粒能在真核細胞中正確表達。從而為其后續的免疫原性研究，以及單個基因與嵌合基因免疫效果的對比研究奠定了基礎。

[1]Kahashi N, Sasakawa C, Yoshikawa M,etal. Molecular characterization of a surface protein antigen gene from serotype C Streptococcus mutans, implicated in dental caries[J].MolecularMicrobiology, 1989，3(5):673-678.

[2]許慶安.防齲疫苗[J]. 中國實用口腔科雜志，2012,5(10)：5921-594.

[3]白國輝，劉建國，柴巧學，等.變異鏈球菌表面蛋白spap P區真核表達質粒的構建及表達[J]. 中國組織工程研究與臨床康復, 2010,14(15):2765-2768.

[4]韓琪，劉建國，曲云鵬，等. 變異鏈球菌葡聚糖結合蛋白真核表達質粒的構建以及在哺乳動物細胞中的表達[J]. 牙體牙髓牙周病學雜志, 2010,20(6):310-313，340.

[5]吳補領,蘇凌云,范繼紅,等. 變異鏈球菌GbpA的GBD融合蛋白誘導SD大鼠產生免疫應答[J]. 中華微生物學和免疫學雜志, 2003,23(6):450-452.

[6]蘇凌云，吳補領，董文波. 變異鏈球菌GbpA的GBD基因疫苗動物免疫防齲研究[J]. 臨床口腔醫學雜志，2006, 22(9):526-528.

[7]樊明文. 防齲疫苗研究的現狀和思考[J]. 中華口腔醫學雜志, 2009,44(2):65-68.

[8]孫天瞳，吳志剛，劉建國. 基因工程嵌合體防齲疫苗的研究現狀[J]. 口腔醫學研究，2014,30(1)：89-92.

[9]Fan MW, Bian Z, PengZX，etal. A DNA VaccineEncodinga Cell- surface ProteinAntigen of Streptococcus mutans ProtectsGnotobioticRats from Caries[J].JDentRes,2002,81(11):784-787.

[10]賈榮,樊明文,邊專, 等. 融合防齲DNA疫苗pGJA- P的構建及其細胞表達研究[J]. 中華口腔醫學雜志, 2002,17(6):456-459.

[11]GuoJH, JiaR, FanMW. Construction and Immunogenic Characterization of a Fusion Anti- caries DNA vaccine against PAc and Glucosyltransferase I of Streptococcus mutans[J].JDentRes, 2004,83(3):266-270.

[12]Sun J,Yang X, Xu QA,etal.Protective efficacy of two new anti-caries DNA vaccines[J].Vaccine, 2009,27(52):7459-7466.

[13]孫靜華,牛玉梅,樊明文，等.變異鏈球菌、表兄鏈球菌復合防齲DNA疫苗的研制[J]. 中華醫學雜志，2009,89(32): 2286-2291.

[14]Niu Y,Sun J,Fan M,etal.Construction of a new fusion anti-caries DNA vaccine[J].JDentRes, 2009,88(5):455-460.

[15]Isaka M,Yasuda Y,Taniguchi T,etal. Mucosal and systemic antibody responses against an acellular pertussis vaccine in mice after intranasal co- administration with recombinant cholera toxin B subunit as an adjuvant[J].Vaccine，2003,21(11-12):1165-1173.

[16]Huy NX, Yang MS, Kim TG. Expression of a cholera toxin B subunit- neutralizing epitopeof the porcine epidemic diarrhea virus fusion genein transgenic lettuce (Lactuca sativa L.)[J].MolBiotechnol, 2011,48:201-209.

[17]楊小青, 姜廣水, 張兆蓮,等. 含變異鏈球菌PAcA基因的真核表達質粒pcDNA3.1- PAcA的構建與鑒定[J]. 山東大學學報(醫學版)，2002,40(4):289-291.

[18]Shi W, Liu F, Yang J,etal. Flagellinenhances saliva IgA response and protection of anti- caries DNA vaccine[J].JDentRes, 2012,91(10)：941-947.

[19]周學東.我國齲病研究的現狀與思考[J]. 中華口腔醫學雜志，2011,46(12)：710-713.

[20]SmithDJ. Prospects in Caries VaccineDevelopment[J].JDentRes, 2012,91(3):225-226.

《牙體牙髓牙周病學雜志》征訂

《牙體牙髓牙周病學雜志》(月刊)是國內唯一的口腔內科學專業雜志，由第四軍醫大學口腔醫學院主辦，為中國科技核心期刊，入選北京大學《中文核心期刊要目總攬》。被美國化學文摘(CA)、美國《劍橋科學文摘(自然科學版)》(CSA)和波蘭《哥白尼索引》(IC)、英國《國際農業與生物科學研究中心》(CABI)、烏利希國際期刊指南(Ulrich's)等國際檢索系統收錄。

本刊設有基礎研究、臨床研究、流行病學、治療與應用、短篇報道、病案報道、綜述、講座、技術革新等欄目，內容包括齲病學、牙體修復學、牙髓病學、牙周病學以及兒童牙醫學、老年牙醫學、牙病預防學等許多領域。

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Construction and expression of recombinant eukaryotic plasmid pVAX1- SPG

WANG Yi- dan*, SUN Tian- tong, LIU Jian- guo, CHAI Qiao- xue,QU Yun- peng, YU Xiao- guang, BAI Guo- hui, Tian Yuan, Han Qi

(*TheFirstPeople′sHospitalofZunyiGuizhou,Zunyi563002,China)

AIM: : To construct the eukaryotic plasmid including surface protein antigen (SpaP) P domain (SpaP- P) and glucan binding domain (GBD) of glucan binding protein A (GbpA) ofStreptococcusmutans, and to observe the expression of recombinant plasmid pVAX1- SPG in mammalian cells 293T. METHODS: The eukaryotic plasmid pVAX1-SPG carrying encoding gene of GBD of GbpA and SpaP- P of SpaP ofStreptococcusmutanswas constructed by recombinant DNA technology. The eukaryotic plasmid was transfected into 293T cells by lipofectamine reagent. The transient expression of the protein in 293T cells was detected by immunochemistry technique and Western-blot. RESULTS: The recombinant plasmidp VAX1- SPG was obtained and identified by restriction endonuclease analysis. Immunohistological staining showed that positive expression of SpaP/P-GBD was detected in the plasma of 293T cells transfected with recombinant plasmid pVAX1-SPG. Western-blot confirmed the expression of the fusion protein SpaP/P- GBD in 293T cells. CONCLUSION: The eukaryotic plasmid pVAX1-SPG can be constructed. The target protein SpaP/P-GBD can be expressed correctively in 293T cells.

streptococcus mutans; surfaceprotein antigen; glucan- binding protein; mammalian cells; eukaryoticexpression

2014-10-11;

2015-03-20

貴州省科技創新人才團隊建設項目[黔科合人才團隊(2013)4026] 貴州省高等學校重點學科建設項目(SZXK-201207-04) 省市科技合作專項資金項目[省市科合(2014)41號] 貴州省高等學校特色重點實驗室建設項目[黔教合KY字(2013)109]

王怡丹(1971-)，女，漢族，貴州遵義人。碩士，副主任醫師

劉建國, E-mail：13087891001@163.com

R780.2

A

1005-2593(2015)11-0645-06

10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.11.002