堿性成纖維生長因子對牙齦間充質干細胞生物學性能的影響

方 穎, 曾素娟, 余 湜, 葛立宏

(1. 廣州醫科大學附屬口腔醫院·廣州口腔疾病研究所·口腔醫學重點實驗室, 廣東 廣州 510140;2. 北京大學口腔醫院，北京 100081)

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·基礎研究·

堿性成纖維生長因子對牙齦間充質干細胞生物學性能的影響

方 穎1, 曾素娟1, 余 湜2, 葛立宏2

(1. 廣州醫科大學附屬口腔醫院·廣州口腔疾病研究所·口腔醫學重點實驗室, 廣東 廣州 510140;2. 北京大學口腔醫院，北京 100081)

目的: 體外研究堿性成纖維生長因子(bFGF)對牙齦間充質干細胞(GMSCs)生物學特性的影響。方法：酶消化法獲得原代人牙齦間充質干細胞(hGMSCs)，并采用有限稀釋法進行克隆純化培養。取第3代hGMSCs，觀察5～20 ng/mL不同濃度bFGF對hGMSCs增殖的影響；觀察10 ng/mL bFGF對hGMSCs克隆形成能力和ALP活性的影響；通過茜素紅染色、油紅0染色，觀察10 ng/mL bFGF對hGMSCs體外成骨、成脂分化能力的影響，并RT-PCR檢測各成骨、成脂分化相關基因的表達水平;同時采用流式細胞術檢測10 ng/mL bFGF對hGMSCs表面標志物STRO- 1表達的影響。結果：10 ng/mL的bFGF對hGMSCs的增殖、干細胞表面標志物STRO- 1的表達、hGMSCs克隆形成率、脂滴形成量以及LPL、PPARγ各成脂基因的表達水平均有明顯的促進作用(P<0.05)；但對hGMSCs的ALP活性，及其成骨分化過程中礦化結節的形成量、各成骨相關基因(ALP、OCN、BSP)的表達水平均有明顯的抑制作用(P<0.05)。結論：在一定的培養條件下，bFGF可增加hGMSCs的干細胞表面標志物的表達、促進hGMSCs的增殖能力；并對hGMSCs的多向分化能力起調節作用。

堿性成纖維生長因子(bFGF); 牙齦間充質干細胞; 細胞多向分化; 細胞增殖

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(11): 639]

Zhang等[1](2009)從牙齦組織來源的細胞中分離得到了干細胞，并開始使用牙齦間充質干細胞(gingiva-derived mesenchymal stem cells, GMSCs)這個概念。GMSCs具有自我更新能力，并可在體外向成骨、成脂及成軟骨方向分化。有研究證實，GMSCs可促進大鼠下頜骨缺損和顱骨缺損的骨組織再生[2]。除此之外，GMSCs還具有顯著的免疫調節功能和抗炎作用[1,3]。GMSCs易于分離，來源廣泛，且具有同質性，其增殖速度比骨髓間充質干細胞迅速。Tomar等[4]報道，GMSCs經多次傳代后，仍能保持正常的染色體核型和端粒酶活性，且無致瘤性，在再生醫學領域及全身系統性疾病的治療方面均有廣闊的應用前景。

堿性成纖維細胞生長因子( basic fibroblast growth factor，bFGF) 屬于肝素結合生長因子家族，是一種含有155個氨基酸的促有絲分裂的陽離子多肽，并在人體內廣泛分布。有研究認為，bFGF在牙齒形態發生和組織發生中均起著重要的作用，并能有效地促進牙根的發育和牙周組織的形成[5-6]。

鑒于bFGF對hGMSCs的影響目前尚未見相關研究報道，本實驗旨在觀察不同濃度bFGF對GMSCs的生長增殖能力、克隆形成能力、干細胞表面標志物以及干細胞多向分化能力的影響。

1 材料和方法

1.1 主要實驗材料和設備

Alpha MEM培養基(Gibco,美國)；鏈霉素、青霉素、Ⅰ型膠原酶、Dispase酶、油紅O(sigma,美國)；FBS(Hyclone，美國)；胰蛋白酶、L-谷氨酰胺、DMSO、CCK8、堿性磷酸酶(ALP)試劑盒(同仁,日本)；地塞米松、β-磷酸甘油鈉、抗壞血酸鈉、茜素紅、多聚甲醛、IBMX 、胰島素、吲哚美辛、慶大霉素、抗STRO- 1抗體(BD，美國)；人bFGF(PeproTech，美國)；Trizol、Superscript Ⅲ逆轉錄試劑盒(Invitrogen，美國)；DEPC(北京鼎國生物技術有限公司)；氯仿、異丙醇、乙醇(北京化學試劑公司)；超凈工作臺、恒溫孵箱、酶標儀(BioTek，ELX808)、倒置顯微鏡(Leica，德國)；流式細胞儀、GeneAmp PCR System、 RT-PCR儀(Biorad，美國)。

1.2 hGMSCs的分離培養和純化

1.2.1 hGMSCs的分離培養

收集臨床上行冠延長術時切取的人健康牙齦組織，用眼科剪剪去其上皮組織，并用含有雙抗(鏈霉素-青霉素)的D-hanks液沖洗3次后，再將其置于加有3 mg/mLⅠ型膠原酶和4 mg/mL Dispase酶各1 mL的培養皿中，并用無菌小彎剪充分剪碎；然后將組織塊連同酶消化液一并轉移至15 mL的離心管中，并置于37 ℃條件下震蕩消化45 min。加入等體積MEM培養基終止消化后，1 200 r/min 離心5 min，去上清；沉淀部分用1 mL含100 mL/L胎牛血清(FBS)的Alpha MEM重懸后，接種于直徑60 mm的培養皿中，并置于37 ℃、50 mL/L CO2孵箱中進行培養。每隔2～3 d換1次培養液，待細胞生長匯合后，胰蛋白酶消化收集細胞，并進行傳代培養。

1.2.2 hGMSCs的純化

采用有限稀釋法對hGMSCs進行克隆篩選。取第1代牙齦間充質細胞，用MEM制成密度為2～3/mL 的單細胞懸液后接種于96孔板(顯微鏡觀察孔內不多于1個細胞)，常規條件下進行培養。待細胞克隆形成明顯，并覆蓋孔底1/2時，將細胞轉種于24孔板進行擴大培養；待細胞生長至匯合后，再將其逐漸移至6孔板中擴增培養以便用于后續研究。

1.3 CCK8法檢測bFGF對hGMSCs增殖能力的影響

取P3代hGMSCs以5×103/孔的密度接種于96孔板，置于37 ℃、50 mL/L CO2孵箱中培養24 h后，棄原培養液，并將細胞隨機分為6組(5個實驗組和1個對照組，每組復6孔)；5個實驗組分別加入含bFGF終濃度為0.5、1、5、10、20 ng/mL的MEM培養液，對照組加入不含bFGF的MEM培養液繼續培養。分別于培養1、3、5、7、9 d各時間點取各組細胞，避光條件下于每孔中各加入10 μL CCK8繼續孵育3 h后，用酶標儀測定各孔450 nm波長處的光密度值(OD)，實驗重復3次。然后以共同培養天數為橫坐標，OD值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.4 bFGF對hGMSCs克隆形成能力影響的觀察

取生長良好的P3代hGMSCs, 以1×103的密度接種于9 cm的培養皿中，常規培養24 h后棄原液，并將細胞隨機分為2組(每組5個培養皿)；實驗組加入含bFGF終濃度為10 ng/mL的MEM培養液，對照組加入不含bFGF的MEM正常培養液繼續培養14 d。培養結束后棄去培養液，用PBS浸洗2次后加入40 g/L多聚甲醛液固定15 min；棄去固定液，加入適量甲苯胺藍染色15 min；PBS浸洗2次，鏡下觀察各組細胞克隆形成情況，并進行克隆計數(以不少于50個細胞的集落計為1個克隆)；然后按以下公式分別計算兩組hGMSCs的克隆形成率。

1.5 流式細胞術檢測bFGF對hGMSCs表達STRO-1的影響

取P3代生長良好的hGMSCs隨機分兩組，分別用含10 ng/mL bFGF的MEM培養液(實驗組)和不含bFGF的MEM培養液(對照組)培養4 d后，用流式細胞儀檢測其干細胞表面標志物STRO- 1的表達。

1.6 bFGF對hGMSCs ALP活性影響的觀察

取P3代hGMSCs以5×104/孔的密度接種于6孔板，常規培養24 h后棄原培養液，并將細胞隨機分為兩組；實驗組為加入含10 ng/mL bFGF的成骨分化誘導液(含50 mg/L抗壞血酸、10 mmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油酸鈉的MEM)，對照組加入不含bFGF的成骨分化誘導液繼續培養。分別于誘導培養后3、5、7 d各時間點取各組細胞，按ALP活性試劑盒說明檢測其ALP活性(總蛋白質濃度作為內參)。

1.7 bFGF對hGMSCs多向分化能力影響的觀察

1.7.1 bFGF對hGMSCs成骨分化能力影響的觀察

1.7.1.1 成骨誘導培養

取P3代hGMSCs以5×104/孔的密度接種于6孔板，常規培養至細胞生長達80%匯合時，棄原培養液，并將細胞隨機分為兩組；實驗組加入含有10 ng/mL bFGF的成骨誘導液(具體成分同1.6)，對照組加入不含bFGF的成骨誘導液繼續培養。每3 d換液1次，連續培養3周后分別進行以下檢測。

1.7.1.2 茜素紅染色觀察礦化結節形成情況

取成骨誘導培養3周的各組細胞，經茜素紅染色后，倒置顯微鏡下觀察其礦化結節形成情況并拍照。

1.7.1.3 RT-PCR檢測各成骨相關基因的表達

取成骨誘導培養3周的各組細胞，用Trizol試劑盒提取細胞總RNA，并用superscript Ⅲ逆轉錄酶將其合成cDNA。然后以cDNA為模板，GAPDH為內參照，進行PCR反應，分別檢測各組細胞中ALP、骨鈣素(Osteocalcin,OCN)、骨涎蛋白(Bone Sialoprotein，BSP)各成骨相關基因的表達水平。PCR反應體系及反應條件均嚴格按照產品說明書，所用引物由上海生工合成，具體引物序列見表1。

1.7.2 bFGF對hGMSCs成脂分化能力影響的觀察

1.7.2.1 成脂誘導培養

取P3代hGMSCs以5×104/孔的密度接種于6孔板，常規培養至細胞生長達80%匯合時，棄原培養液，并將細胞隨機分為兩組；實驗組加入含10 ng/mL bFGF的成脂誘導液(Alpha MEM培養基、100 mL/L FBS、0.5 mmol/L IBMX、1 μmol/L DEXO、10 μmol/L重組人胰島素、120 μmol/L吲哚美辛、50 μg/L慶大霉素)，對照組加入不含bFGF的成脂誘導液繼續培養。每3 d換液1次，連續培養4周后分別進行以下檢測。

1.7.2.2 油紅O染色觀察脂滴形成情況

取成脂誘導培養3周的各組細胞，經油紅O染色后，倒置顯微鏡下觀察其脂滴形成情況并拍照。

1.7.2.3 RT-PCR檢測各成脂相關基因的表達

取成骨誘導培養3周的各組細胞，按1.7.1.3 同樣的方法提取細胞總RNA，并逆轉錄合成cDNA。然后以cDNA為模板，以GAPDH為內參照，進行PCR反應，分別檢測各組細胞中LPL(Lipoprotein lipase)、PPARγ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma)各成脂相關基因的表達水平，PCR反應體系及反應條件均嚴格按照產品說明書，所用引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 hGMSCs的分離培養結果

酶消化法獲得的hGMSCs呈典型的成纖維細胞狀態，并具有克隆形成能力(圖1a)；傳代后大多數細胞呈長梭形或短梭形，生長快慢不等，傳至5～6 代時其形態均無明顯改變，具有成體干細胞的特征(圖1b)。

圖1 原代及傳代培養的hGMSCs(×4)

2.2 不同濃度bFGF對hGMSCs增殖能力的影響

CCK8檢測結果顯示，5～20 ng/mL 不同濃度的bFGF與hGMSCs共同培養1～9 d后，各濃度組在3、5、7、9 d各時間點的細胞增殖能力(OD值)均明顯高于對照組(P<0.05)，bFGF濃度為10 ng/mL組的細胞增殖能力最強，與其他各濃度組相比，各時間點均有統計學差異(P<0.05)(圖2)。

圖2 不同濃度bFGF對hGMSCs增殖能力的影響

2.3 bFGF對hGMSCs克隆形成能力的影響

單克隆挑選培養14 d 后，對照組的平均克隆形成率為0.28%(28個集落/103個細胞)，實驗組的平均克隆形成率為0.41%(41個集落/103個細胞)，兩組間差異有統計學意義(P<0.05) 。

2.4 bFGF對hGMSCs表面標志物STRO-1表達的影響

STRO-1是經典的hGMSCs表面標志物。本實驗中流式細胞儀檢測結果顯示，用含有10 ng/mL bFGF的培養液培養的hGMSCs中，STRO-1的表達率為19.8%，而不含bFGF培養液培養的hGMSCs(對照組)中，STRO-1的表達率為10.4%，兩者有統計學差異(P<0.05)(圖3)。

bFGF(-) bFGF(+)

圖3 bFGF對hGMSCs表達STRO-1的影響

圖4 10 ng/mL bFGF對hGMSCs成骨分化過程中ALP活性的影響

2.5 bFGF對hGMSCs成骨分化過程中ALP活性的影響

用含有10 ng/mL bFGF的成骨誘導液對hGMSCs進行誘導培養3、5、7 d后，ALP活性檢測結果顯示：實驗組各時間點的ALP活性均較對照組有所降低，其中以第5天時的降低程度最明顯，差異有統計學意義(P<0.05)(圖4)。

2.6 bFGF對hGMSCs成骨分化能力的影響

用含有10 ng/mL bFGF的成骨誘導液對hGMSCs進行誘導培養3周后，茜素紅染色結果顯示，實驗組細胞的礦化結節形成量低于對照組(圖5)；RT-PCR檢測結果顯示，實驗組中ALP、ONC、BSP各成骨相關基因的表達水平均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)(圖6)。以上結果提示，10 ng/mL bFGF對hGMSCs的成骨分化具有抑制作用。

2.7 bFGF對hGMSCs成脂分化能力的影響

用含有10 ng/mL bFGF的成脂誘導液對hGMSCs進行誘導培養4周后，油紅O染色結果顯示，實驗組細胞中的脂滴形成面積明顯大于對照組(圖7)；RT-PCR檢測結果顯示，實驗組中LPL、PPARγ各成脂相關基因的表達水平均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)(圖8)。

對照組 實驗組

圖5 bFGF對hGMSCs成骨分化的影響(茜素紅染色，×4)

圖6 bFGF對hGMSCs成骨相關基因表達的影響(相同字母P<0.05)

對照組 實驗組

圖8 bFGF對hGMSCs成脂分化過程中成脂相關基因表達的影響(相同字母P<0.05)

3 討論

GMSCs不僅具有自我更新和多向分化的能力，同時還在免疫調節及抗炎方面起著重要的作用[1-3]。GMSCs自首次分離以來，因其來源廣泛，取材方便，在再生醫學領域有著廣闊的應用前景，并已成為干細胞新的研究熱點。而對于bFGF的研究則開始的更早，且研究的更深[7]。在再生醫學研究中，如何選擇合適的干細胞和生長因子，并確保后者能對前者產生最佳的調控效果，一直是學者們關注的焦點。

本實驗主要研究bFGF對GMSCs生物特性的影響，從實驗結果可以看出，bFGF不僅能促進GMSCs的增殖，并促進其干細胞表面標志物STRO-1的表達，同時還對GMSCs的成脂分化具有增強作用。然而，在GMSCs成骨分化的早期，bFGF則對其堿性磷酸酶的活性、成骨相關基因的表達、礦化結節的形成等均具有抑制作用。由此可以認為，bFGF可以增強GMSCs的干性，即在體外不僅能增強GMSCs的自我更新能力，同時還對細胞的分化能力具有調節作用。

其他相關研究也表明，bFGF與牙髓干細胞、脂肪干細胞、人根尖牙乳頭細胞共同培養后，可降低其成骨分化過程中的礦化結節的形成量，并抑制其成骨相關基因的表達水平[8-9]。本結果與上述結論基本一致，并進一步證實了bFGF在細胞分化的不同階段均具有一定的調節作用。

除此之外，bFGF作為分裂源和化學引誘物,在脂肪干細胞和骨髓間充質干細胞的多向分化過程中，還能促進血管生成、細胞遷移及其成脂分化[10-12]。Vashi等[12]研究發現，低溫保存的人脂肪干細胞與10 ng/mL bFGF和EGF共同培養時，其細胞的增殖能力增加了3倍；在該細胞的擴大培養過程中加入上述兩種因子并進行成脂誘導后，油紅O染色顯示，其脂滴形成的面積顯著增大。本實驗單獨研究了bFGF對GMSCs成脂分化的作用，實驗結果表明，bFGF能促進牙齦間充質的成脂分化，而且這種是改變是基因水平的。進一步證實了bFGF對GMSCs的分化具有調控作用。

綜上所述，bFGF 作為一種重要的細胞因子，其對細胞的作用是廣泛而復雜的。本研究只是從一個側面來研究了bFGF對GMSCs的影響，并發現bFGF對GMSCs的影響是在基因水平上的，而且在傳代后依然存在。在今后的實驗中還將從蛋白水平以及體內實驗等方面進行更加深入細致的研究，以期更好的掌握bFGF對GMSCs細胞分化的調控作用，并建立具有科研和臨床意義的細胞系。

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Effects of basic fibroblast growth factor on the biological charactor of gingiva- derived mesenchymal stem cells

FANG Ying*, ZENG Su- juan, YU Shi, GE Li- hong

(*KeyLaboratoryofOralMedicine,GuangzhouInstituteofOralDisease,StomatologyHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510140,China)

AIM: To investigate the effects of basic fibroblast growth factor (bFGF) on the biological charactor of gingiva-derived mesenchymal stem cells (GMSCs) in vitro. METHODS: GMSCs were isolated from human healthy gingival tissue samples. Proliferation, colony formation, alkaline phosphatase (ALP) activity, STRO- 1 expression, osteogenic and adipogenic differentiation of GMSCs cultured in the presence or absence of bFGF, were evaluated. RESULTS：Treatment with 10 ng/mL bFGF significantly increased the proliferation and STRO- 1 expression of GMSCs. bFGF also increased oil red O staining following adipogenic induction and the expression of PPARγ and LPL of GMSCs. In contrast, it reduced the ALP activity and mineral nodule formation; inhibited the gene expression of ALP, OCN and BSP of GMSCs. CONCLUSION: Under certain conditions, bFGF enhances GMSCs stemness by up-regulating stem cell gene expression, increasing proliferation ability, and may regulate the differentiation potency of GMSCs.

basic fibroblast growth factor(bFGF); gingiva-derived mesenchymal stem cells(GMSCs); cell differentiation; cell proliferation

2015-08-18

國家自然科學基金面上項目(81170928)

方 穎(1989-)，女，漢族，湖北黃岡人。碩士生(導師: 葛立宏)

葛立宏, E-mail: gelh0919@126.com; 曾素娟, E-mail: 13922265473@163.com

R780.2

A

1005-2593(2015)11-0639-06

10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.11.001