基于氫鍵誘導的納米金比色傳感器實時檢測脂肪酶活性

劉佳等

關鍵詞 脂肪酶； 酶活性； 納米金； 氫鍵； 比色傳感

1 引 言

脂肪酶（3.1.1.3）被認為是繼蛋白酶、糖化酶之后的又一重要工業用酶。工業用脂肪酶大多來源于微生物，篩選活力高、產量高及低成本的脂肪酶菌種是其關鍵技術環節，在脂肪酶的改造、分離、純化以及重組蛋白的篩選等領域，脂肪酶活力的測定都是不可缺少的關鍵技術，因此， 建立高通量的酶活性檢測方法對于促進酶學研究和酶工程技術的發展都具有重要意義[1～4]。

目前，脂肪酶活性檢測普遍采用酸堿滴定法[5]、濁度法[6]及光度法[7]，但這些方法多存在靈敏度不高、誤差大、且費時費力、不適用于高通量檢測等不足。熒光法[7]雖然靈敏度較高，但大部分可被脂肪酶水解的熒光底物均受限于反應介質的酸度，另外熒光猝滅等因素還可能影響實驗結果的精確性。對于動輒數以千計的定向進化庫而言，要進行高通量酶檢測，這些方法存在較大局限性。因此迫切需要建立高靈敏度、高選擇性，更加簡單、快速、準確的脂肪酶檢測方法。

納米金因其獨特的表面等離子體共振（SPR）效應成為構建生物傳感器的優良材料，已被用于多種酶分析研究中[8～11]，尤其是基于納米金的比色檢測方法由于其簡單、快速已成為高通量檢測方法之一[12]。

本實驗以巰基乙酸甲酯修飾的納米金（MTAuNPs）為比色探針，構建檢測脂肪酶活性的生物傳感器。在弱酸性磷酸緩沖溶液中，脂肪酶水解切割MTAuNPs 上的MT，生成羧酸根。通過調節溶液pH值至酸性，帶有羧酸根殘基的納米金之間能夠形成較強氫鍵，誘導AuNPs聚集變色，基于此建立了氫鍵誘導納米金比色傳感方法檢測脂肪酶的活性（如圖1所示）。與傳統方法相比，本方法具有快速、簡單、價廉、靈敏度高等優勢，可用于高通量、實時檢測脂肪酶活性。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

SpectraMax M3微孔板檢測系統 （美國分子儀器公司）； JEM200 CX透射電子顯微鏡 （日本電子株式會社）； B260恒溫水浴鍋 （上海亞榮生化儀器廠）； 電子天平（德國賽多利斯公司）； PHS3C pH計（上海雷磁公司）； 氯金酸、NaH2PO4、Na2HPO4、檸檬酸鈉、檸檬酸、NaOH均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）； 巰基乙酸甲酯（MT， 95%，百靈威科技有限公司）； 諾維信435脂肪酶（Novozymes 435，諾維信投資有限公司）； 根霉脂肪酶（RNL， 1.5 U/mg）、豬胰脂肪酶（PPL）、洋蔥假單胞脂肪酶（CRL）、假單胞菌脂肪酶（PSL）、食品脂肪酶（FNL， SigmaAldrich （上海）貿易有限公司）。

2.2 納米金的合成

采用檸檬酸鈉還原法合成納米金[12]： 300 μL HAuCl4 （0.1 mol/L） 溶液加入含有100 mL超純水的三口燒瓶中，劇烈攪拌且加熱至沸騰； 2 min后加入4 mL現配的檸檬酸鈉溶液（38 mmol/L），溶液顏色由黃色逐漸變為透明酒紅色，繼續反應10 min后停止加熱，自然冷卻到室溫。制得的AuNPs溶液在4 ℃保存備用。

2.3 巰基乙酸甲酯（MT）修飾納米金

移取適量AuNPs溶液（2.3 nmol/L）和MT溶液（1.0 μmol/L）混合，使其最終摩爾比為1∶50。在室溫下，輕微振蕩2 h， 使MT在溶液中分散均勻，再靜置 10 h，即得MT修飾的納米金（MTAuNPs）。

采用本研究建立的脂肪酶活力測定方法，可以直接采用吸光度比值（A650/A520）作為表征脂肪酶活力大小的參數，A650/A520越高，表明脂肪酶活力越大[14]。由表1可見，采用本文方法，各商品酶的活力大小即A650/A520大小依次為：Novozymes 435>PPL>CRL>FNL>PSL，與電位滴定法測定的酶活力大小順序一致。雖然電位滴定法和本方法所用的酶活表示方法不同，但其酶活性的變化趨勢是完全一致的。因此，本實驗構建的MTAuNPs 生物探針可簡單快速的進行脂肪酶活性檢測，在酶活基礎研究和實際應用中具有潛在的應用價值。

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