TNF—α預處理臍血間充質干細胞移植心肌梗死大鼠心功能影響

樊志剛　劉芳

[摘 要] 目的：研究腫瘤壞死因子（TNF-α）預處理的臍血間充質干細胞（HUMSC）血管細胞黏附分子-1的表達及其對心肌梗死大鼠心功能的影響。方法：實驗組取第3代HUMSC用TNF-α（10 ng/mL）預處理24 h后，遷移黏附實驗檢測其體外遷移黏附能力，Western blot檢測VCAM-1蛋白表達；對照組不用TNF-α處理。動物實驗分為實驗組（注射TNF-α預處理HUMSC）和對照組（注射HUMSC），取第3代HUMSC移植于心肌梗死大鼠的心肌內3周后，二維超聲心動圖檢測大鼠左心室心功能。結果：與對照組比較，實驗組體外遷移黏附力明顯增強（P<0.05）；黏附分子VCAM-1的蛋白表達水平顯著升高（P<0.05）；左心室射血分數明顯提高（P<0.05）。結論：移植TNF-α預處理的HUMSC更能明顯改善大鼠心功能，其機制可能與TNF-α提高HUMSC黏附分子VCAM-1的蛋白表達水平相關。

[關鍵詞] 腫瘤壞死因子-α；臍血間充質干細胞；黏附分子

中圖分類號： R332 文獻標識碼： A 文章編號：2095-5200（2015）04-004-05

每年全球約有1700萬人死于心血管病，其中占總數1/2患者死于急性心肌梗死（AMI）[1]。過去30年中，MI病死率（30 d內）雖然已降至10% ，但年病死率仍為20% 左右[2]。目前，MI治療方法以藥物、介入和外科手術為主，這些方法可解除血管阻塞，緩解心室重構，延緩和改善心功能惡化及心律失常發生，但無法逆轉壞死心肌，使已梗死心肌細胞再生。而干細胞治療給人們帶來了新希望。

MSC具有多向分化潛能、支持和促進造血干細胞植入、調節免疫以及分離、培養時操作簡便等特點[3]。臍血間充質干細胞（Human Umbilical cord blood mesenchymal stem cells，HUMSC）是從臍帶組織中分離出來，較祖細胞更原始，有更強增殖分化能力[4]；免疫原性較為幼稚，不易觸發免疫反應或引起移植物抗宿主??；較骨髓MSC有更大應用潛能。

循環血液中干細胞歸巢到缺血組織中是組織修復第一步，干細胞歸巢第一步就是黏附于心臟微血管內皮細胞[5]，因此提高移植干細胞向受損組織遷移及定植對提高干細胞治療效果具有重要價值。黏附分子廣泛存在于細胞表面及細胞外基質中，通過與受體結合，介導細胞與細胞或細胞與細胞外基質接觸，并參與細胞活化與遷移[6]。在炎癥、缺血性損傷及傷口愈合等過程中發揮重要作用。生理狀態下充質干細胞少量表達血管細胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1），而明顯表達細胞間黏附分子（intercellular adhesion molecule-1，ICAM）[7]。Segers等[8] 研究發現，VCAM-1對BMMSCs黏附于心肌微血管內皮細胞具有重要作用，在加入VCAM-1抗體后可完全消除由腫瘤壞死因子 （tumor necrosisfactor，TNF-α）預處理增強MSC對內皮細胞黏附性，而加入ICAM-1抗體則MSC對內皮細胞黏附能力卻沒有明顯變化。所以本研究用采用TNF-α預處理HUMSC，通過遷移黏附能力、VCAM-1表達和左心室功能變化等檢測指標，探討其對心肌梗死大鼠治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SD大鼠20只，清潔級，220～250 g用于心肌梗死造模，購自河南省實驗動物中心，實驗中對動物處置符合動物倫理學要求。

1.2 主要試劑和儀器

L-DMEM、胎牛血清（fetalbovine serum，FBS）購自美國Hyclone公司；0.25%胰酶、SDS-PAGE凝膠試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；TNF-α購自美國Peprotech公司；PVDF膜購自美國Sigma公司；VCAM-1一抗購自美國Bioworld公司；β-actin、二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；倒置顯微鏡Olympus BX41購自日本Olympus公司；二維多普勒超聲儀購自美國Phillips公司。

1.3 臍血間充質干細胞分離和培養

臍血來自于鄭州市婦幼保健醫院產婦志愿捐獻足月妊娠順產嬰兒，參照文獻[9]采用密度梯度離心法獲取HUMSC，將分離細胞以5×106/mL接種于含體積分數為20%胎牛血清DMEM/F12培養液中培養。取第3代細胞用于后續實驗。

1.4 細胞鑒定

將第3代HUMSC調整為1×106 /L 細胞懸液，用流式細胞儀進行細胞表面標志測定。細胞分別與鼠抗人FITC-CD90、PE-CD86、FlTC-CD45，PE-CD19、FITC-CD105、PE-HLA-DR、FITC-HLA-ABC和PE-CD34抗體反應，在4℃暗室中放置30min。以鼠抗人PE/FITC-IgG1為平行對照。數據用Cell Quest軟件處理。

1.5 體外遷移實驗

將第3代HUMSC濃度調整為5×106/mL，取100 μL細胞懸液接種于8 μm孔徑24孔transwell小室上層，下層加入500μL含2%FBSL-DMEM培養基，實驗組下層培養液中加入TNF-α使得其終濃度為10 ng/mL，對照組加入等體積PBS，置于細胞培養箱中繼續培養。24 h后取出小室，用熒光倒置顯微鏡下觀察并隨即選取6個視野拍照后計數遷移至膜下表面細胞數目。

1.6 體外黏附實驗

將第3代HUMSC長至80%融合時，實驗組加入TNF-α（10 ng/mL）處理，培養24 h后，調整細胞濃度為1×106/mL，取1 mL細胞懸液經1200 r/min離心3min后重懸于250μLL-DMED中，然后接種于膠原包被24孔板，靜置15 min后，用PBS洗兩遍，去除未貼壁干細胞。顯微鏡下隨機選取6個視野拍照后計數。

1.7 Western blot檢測黏附分子蛋白表達

實驗組加入TNF-α（10 ng/mL）處理，培養24 h后，調整細胞濃度為1×106/mL，加入上樣緩沖液后100℃水浴變性5 min，10SDS-PAGE電泳，轉移至PVDF膜上。封閉液封閉2 h，加一抗孵育12h，HRP標記二抗孵育2 h。洗膜后將增強化學發光液（ECL）涂于PVDF膜上，曝光并采集圖像。Ge1-Pro analyzer 4軟件分析蛋白條帶，以β-actin表達量作為參照。

1.8 大鼠心肌梗死模型制備和細胞移植

麻醉大鼠后，接心電監護、氣管插管并接上小動物呼吸肌，于心前區肋間隙進入胸腔并刺破心包，在與左心耳交界處下方0.2cm處縫扎左前降支動脈，可見心電監護ST段顯著抬高。術后關胸常規肌注30萬U青霉素，心肌梗死模型復制成功后1周，大鼠隨機分為對照組和實驗組各10只。對照組大鼠梗死局部心肌內注射HUMSC100μL（1×105個），實驗組大鼠梗死局部心肌內注射第3代TNF-α預處理HUMSC100μL（1×105個），所有動物隨后關胸并給予抗生素處理。

1.9 超聲心動圖檢測大鼠心功能

移植后3周，大鼠麻醉后固定于鼠板上，二維多普勒超聲儀檢測大鼠左心室舒張末內徑（left ventricular end-diastolic dimension，LVEd）、左心室收縮末內徑（left ventricular end- systolic dimension，LVDs），按照公式：LVEF=[（ LVDd）3-（ LVDs）3]/ （ LVDd）3×100%計算射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF）。

1.10 統計學處理

采用GrahPad Prism 5.0統計軟件進行分析，數據以x±s表示，兩組間比較用t檢驗，a=0.05。

2 結果

2.1 臍血間充質干細胞分離培養

倒置顯微鏡下可見，培養初期胞體小且呈圓形（圖1A），2d以后逐漸變為橢圓、胞體變大（圖1B），7d（第3代）后向兩級伸出凸起為長梭形（圖1C）。

2.2 細胞檢測結果

流式細胞儀檢測結果顯示CD34、CD45陽性率不足10%，提示大部分人臍帶間充質干細胞不是造血干細胞。CD19和CD86陽性率少于10%，CD90、CD105陽性率高于70%，主要組織相容性復合體HLA-ABC陽性率為90% 以上，HLA-DR陽性率低于5%，結果提示人臍帶間充質干細胞和間充質干細胞細胞表型相似。

2.3 體外遷移能力

結果表明與TNF-α共培養24h后，TNF-α處理組從小室表面遷移到小室下表面細胞數目（26.4±2.8）明顯多于PBS組（6.9±1.7），差異有統計學意義（P<0.05）。說明TNF-α可以增強干細胞體外遷移能力。（見圖2a/b）

2.4 體外黏附能力

結果表明與TNF-α共培養24h后，TNF-α處理組黏附于培養板細胞數目（41.2±3.6）明顯高于PBS組（7.8±1.3），差異有統計學意義（P<0.05）。說明TNF-α可以顯著增強干細胞黏附能力。（見圖3a/b）

2.5 黏附分子VCAM-1表達

用Western blot法檢測轉移至膜上蛋白含量，結果表明，PBS組VCAM-1表達較低，TNF-α處理組能顯著誘導VCAM-1蛋白合成，約為對照組3倍，兩組間差異具有統計意義（見圖4）。

2.6 TNF-α預處理HUMSC對大鼠心功能影響

移植后3周，對照組（HUMSC）有2只大鼠死亡，實驗組（TNF-α預處理HUMSC）有1只大鼠死亡。LVDd、LVDs、LVEF結果見表1，多普勒超聲心動圖結果顯示，實驗組LVEF明顯高于對照組（P<0.05）。說明經TNF-α預處理HUMSC移植可以明顯改善心功能。

3 討論

MSC具有較強擴增能力，可分化成心肌樣細胞和有助于血管形成血管平滑肌細胞以及血管內皮細胞，能參與心肌缺血引起心肌重構和血管再生，達到替代損傷心肌細胞，改善心功能目[10]。由于MSC缺少主要組織相容性復合體II ，可參與免疫調控但具免疫豁免性，增強了異體細胞移植安全性，因此最有可能發展成標準化治療，從而滿足大部分人治療需求[11]。很多研究者認為，干細胞可能是通過旁分泌而不是替代梗死心肌來發揮改善心功能作用[12-13]，目前已發現多種干細胞因子以旁分泌產生作用[14-15]。

臍血中含有豐富間充質干細胞[16]，是近年發現具有與骨髓干細胞細胞（BMMSC）相同多向分化潛能原始祖細胞，和其他來源干細胞相比，臍血來源廣泛，臍血中淋巴細胞免疫功能不夠成熟，免疫原性較弱，移植物抗宿主病發生率較低[17-18]；HUMSC易于分離[19-20]為一種新可靠干細胞來源，在適當條件下具有向神經細胞、成骨細胞、心肌細胞等組織細胞多項分化潛能[21]。

目前，已有多種干細胞應用于MI臨床治療研究[22-23]，但HUMSC移植治療MI還比較少。干細胞移植治療主要困難之一是移植干細胞只有很少一部分能存活和植入心肌中。所以如何提高干細胞移植存活率成為研究者首當其沖問題。Luo 等[24-25]研究發現在梗死區邊緣區注入高表達血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）干細胞，可以減少梗死區面積，增加梗死區周圍心肌血管生成，促進冠脈結扎實驗中心臟功能恢復。Ries 等[26]研究發現提高BMMSC基質金屬酶表達，可以促進細胞趨化和遷移。

心肌梗死后會釋放大量炎癥介質，這些介質一方面可以促進組織修復和增強心肌對缺血適應，但另一方面這些介質也可以促進心肌細胞凋亡和加快基質降解進而抑制和減低心功能[27-29]。以前研究重視干細胞移植后如何降低炎癥因子表達，但新近有研究[30-32]證實用炎癥因子處理過干細胞移植能明顯改善心功能，促進心肌功能恢復。Herrmann等[33]研究發現，用TGF-a預處理24h BMMSC移植可以增加VEGF表達，進一步保護大鼠心肌和減少壞死區域面積。

本研究之所以選擇TNF-α濃度為10 ng/mL是因為這一濃度刺激可以激活干細胞旁分泌而不改變其表面活性物質[34]。有研究[35]顯示移植MSC可以促進梗死區炎性因子如TNF-α、白介素-6和轉化生長因子等釋放，這些因子又對細胞旁分泌起重要作用。因此研究移植后干細胞對炎性環境應答對提高其存活率和改善心功能有更重要價值。

參 考 文 獻

[1] Psaltis PJ，Zannettino AC，Worthley SG，et a1.Concise review：mesenchymal stromal cells：potential for cardiovascular repair.Stem Ceils[J].2008，26（1）：2201-2210.

[2] Przybyt E，Harmsen MC.Mesenchymal stem cells：promising for m yocardial regeneration Curr Stem Cell Res Ther[J].2013，8（2）：270-277.

[3] Ballard VI .Stem ceils for heart failure in the aging heart[J].Hear Fail Rev，20l0，15（1）：447-456.

[4] Hodgkinsol CP，Gomez JA，Mrotsou M，et a1.Genetic engineering of mesenchymal stem cells and its application in human disease therapy[J].Hum Gene Ther，2010，21（2）：1513-1526.

[5] Hodgkinson CP，Gomez JA，Rotsou M.Genetic engineering of mesenchymal stem cells and its application in human disease therapy[J].Hum Gene Ther，2010，21（2）：1513-1526.

[6] Miettinen JA，Salonen RJ，Ylitalo K，et a1.The effect of bone marrow microenvironment on the functional properties of thetherapeutic bone marrow derived cells in patients with acute myocardial infarction[J].J Transl Med，2012，10（1）：66.

[7] Hyun Y M ，Chung H L，McGrath J L，et a1.Activated integrin VLA 4 localizes to the lamellipodia and mediates T cell migrationon VCAM-1[J].J Immunol，2009，183（1）：359-369.

[8] Segers V F，Van-Riet Andries LJ， et al.Mesenchymal stem cell adhesion to cardiac microvascular endothelium：activators and mechanisms[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006，290（4）：1370-7.

[9] Pucilowska J，Puzerey PA，Karlo JC，et a1.Disrupted erk signaling during cortical development leads to abnormal progenitor proliferation， neuronal and network excitability and behavior， modeling human neuro-cardio-facial-cutaneous and related syndromes.[J]. J Neurosci，2012，32（25）：8663-8677.

[10] Herrmann JL，Abarbanell AM，Weil BR，et a1.Optizing stem cell function for the treatment of ischemic heart disease[J].Surg Res，2011，166：138-145.

[11] Hoover Plow J，Gong Y.Challenges for heart disease stem cell therapy[J].Vasc Health Risk Manag，2012，8（2）：99 -113.

[12] Ballard VL.Stem cells for heart failure in the aging heart[J].Heart Fail Rev，2010，l5（1）：447-456.

[13] Wen J，Zhang JQ，Wei H，et a1.SDF 1q and CXCR4 as therapeutic targets in cardiovascular disease[J].Am J Cardiovasc Dis，2012，2（2）：20-28.

[14] Fedak PW.Paracrine effects of cell transplantati0n： modifying ventricular rem odeling in the failing heart[J].Sen Thorac Cardiovase Surg，2008，20（1）：87-93.

[15] Herrmann JL，Abarbanell AM，Weil BR，et a1.Optizing stem cell function for the treatment of ischemic heart disease[J].J Surg Res，2011，166（3）：138-145.

[16] Biuqstud K B， Tenq Y G，Redmond D E，et a1.Human neural stem cells migrate along the nigrotriata1 pathway in a primatemodel of Parkinsons disease[J].ExpNeurol，2008，211（2）：362-369.

[17] Sanders RD，Xu J，Shu Y，et a1. Dexmedetomidine attenuates isoflurane—induced neurocoguitive impairment in neonatal rats [J].Anesthesiology，2009，110（5）：1077-1085.

[18] Sande RD，Sun P，Pate1 S，et a1. Dexmedetomidine provides cortical neuroprotection： impact on anaesthetic‐induced neuroapoptosis in the rat developing brain[J].Acta Anaesthesiol Scand， 2010，54（6）：710-716.

[19] Pucilowska J，Puzerey PA，Karlo JC，et a1.Disrupted erk signaling during cortical development leads to abnormal progenitor proliferation， neuronal and network excitability and behavior， modeling human neuro-cardio-facial-cutaneous and related syndromes.[J]. J Neurosci，2012，32（25）：8663-8677.

[20] Biuqstud K B，Tenq Y G，Redmond D E，et a1.Human neural stem cells migrate along the nigrotriata1 pathway in a primatemodel of Parkinsons disease[J].ExpNeurol，2008，211（2）：362-369.

[21] 王蒙 ，楊媛.人臍血源性MSCs成骨誘導分化后對DCs免疫抑制研究[J]. 免疫學雜志，2012，28（11）：959-963.

[22] Nabel E G，Brannwald E.A tale of coronary artery disease and myocardial infarction[J].N Engl J Med，2012，366（1）：54-63.

[23] Nasef A，Fouillard L，Ashammakhi N.Immunomodulatory effect of mesenchymal stromal cells：possible mechanisms[J].RegenMed，2008，3（4）：531-46.

[24] Luo Y，Wang Y，Poyntcr J A，et a1. Pretrcating mesenchymal stem cels with interleukln-1β and transforming growth factor– β psynergistically increases vascular endothelial growth factor production and improves mesenehymal stem cell--mediated myocardial protection after acute ischemia[J].Surgery，2012，151（3）：353-63.

[25] Ries C，Egea V，Karow M，et a1.MMP-2，MT1，MMP，and TIMP-2 are essential forthe invasive capacity of human mesenehymalstem cells：differential regulation by inflammatory cytokines [J].Blood，2007，109（9）：4055-63.

[26] Nian M，Lee P，Khaper N，et a1.Inflammatory cytokines and postmyoeardial infarction remodeling[J].Circ Res，2004，94（12）：1543-1553.

[27] Egea V，yon Baumgarten L，Schichor C，et a1.TNF-13t respecifies human mesenchymal stem cells to a neural fate an d promotes migration toward experimental glioma[J].Cell Death Differ，2011，18（5）：853-863.

[28] Tit，XM，Peyton KJ，Shebib AR，et a1.Activation of AMPK stimulates heme oxygenase-1 gene expression and human endothelial cell survival[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2011，300（3）：84-93.

[29] Jazwa A，Stepniewski J，Zamykal M，et a1.Pre-eruptivehypoxia regulated HO-1 gene therapy improves postischaemic limb perfusion and tissue regeneration in mice [J].Cardiovasc Res，2013，97（4）：115-124.

[30] Yaghoubi SS，Campbell DO，Radu CG，et a1.Positron emission tomography reporter genes and reporter probes：gene and cell therapy applications[J].Theranostics，2012，2（1）：374 -391.

[31] Wu ML，Ho YC，Lin CY，et a1.Heme oxygenase-1 in inflammation and cardiovascular disease [J].Am J Cardio-vasc Dis，2011，1（2）：150-158.

[32] Terrovitis JV，Smith RR，Marb6n E.Assessment and optimization of cell engraftment after transplantation into the heart[J].Circ Res，2010，106（3）：479-494.

[33] Henmann J L，Abarbanell A M，Wang Y，et al.Transforming growth faetor etenhances stem cell mediated postischemic myocardial protection[J].Ann Thorae surg，2011，92（5）：1719-1725

[34] Xiao Q，Wang sK，Tian H，et al. INF-otincreases bonemal Tow mesenehymalstem cell migration to ischemic tissues[J].Cell Biochcm Biophys，2012，62（3）：409-414.

[35] Armifi6n A，Gandfa C，Garcia Verdugo JM，eta1.Mesenehymal stem cells provide better results than hematopoietic precumom for the treatment of myocardial infarction[J].J Am Coll Cardiol，2010，55（2）：2244-2253.