甲基化調節miR-200b的表達及其對胃癌MGC-803細胞增殖侵襲能力的影響

郭蓉，寧向紅，姜葵，張慶瑜

甲基化調節miR-200b的表達及其對胃癌MGC-803細胞增殖侵襲能力的影響

郭蓉，寧向紅，姜葵，張慶瑜△

目的 體外研究基因miR-200b發生甲基化的不同程度及其表達量的差異對胃癌細胞MGC-803增殖、侵襲、凋亡及對上皮間質轉化的影響。方法 以正常胃黏膜上皮細胞GES-1、胃癌細胞MGC-803為研究對象，提取細胞總RNA，逆轉錄后進行實時熒光定量PCR檢測2種細胞系中miR-200b的表達量；亞硫酸氫鈉修飾PCR（BSP）法檢測miR-200b啟動子區甲基化水平。用不同濃度5-氮雜胞苷（5′-Aza-CdR）藥物處理MGC-803細胞72 h后，同法檢測miR-200b的表達量及啟動子區甲基化水平變化。根據上述實驗結果選擇合適的藥物作用濃度和時間即（10 μmol/L，72 h）作為處理組。通過Transwell侵襲實驗觀測細胞侵襲能力；流式細胞技術檢測細胞周期及凋亡的分布情況；Western-blot檢測上皮間質轉化（EMT）相關指標E-cadherin、N-cadherin、ZEB1、Slug、基質金屬蛋白酶（MMP）9等的表達水平。結果 miR-200b在GES-1中表達量較MGC-803高（P=0.022）。啟動子區甲基化水平則與之相反（P=0.034）。藥物不同濃度作用后的MGC-803細胞系miR-200b表達量有隨濃度升高而升高的趨勢，作用濃度為10 μmol/L時miR-200b啟動子區甲基化水平較對照組低（P=0.043）。與對照組相比，處理組細胞晚期凋亡數增多；G0/G1期細胞數顯著增多，S期顯著減少；穿過Transwell小室細胞數顯著減少；Western-blot實驗表明E-cad?herin表達量升高，N-cadherin、ZEB1、Slug、MMP9表達量降低。結論 miR-200b啟動子區甲基化程度的不同可以影響其表達量，而miR-200b表達量的異常又與胃癌MGC-803細胞增殖、侵襲能力密切相關。

胃腫瘤；腺癌；細胞凋亡；細胞增殖；DNA甲基化；微RNA-200b

表觀遺傳學修飾包括DNA甲基化及組織蛋白乙?；?，它們在腫瘤形成和發展過程中有很重要的作用，尤其是DNA甲基化［1］。DNA甲基化是在甲基轉移酶的催化下，DNA的CG 2個核苷酸的胞嘧啶被選擇性地添加甲基形成5-甲基胞嘧啶后對腫瘤進行調節的。研究已證實，基因啟動子區發生異常甲基化后可對腫瘤的發生、發展產生一定的影響，如P21基因啟動子區高度甲基化后導致表達量降低，同時增加了乳腺癌的發病率［2］；miR-200b和甲基化轉移酶抑制劑共同作用可以在不同程度上阻止間質表型肝細胞癌發生肺轉移［3］。Micro-RNAs是由19～22個核苷酸組成的非編碼RNA，主要結合在目標mRNA的3′非翻譯區（3′-UTR），通過轉錄后水平對基因表達進行調節［4］。Mi-RNAs的表達模式具有高度保守性、時序性和組織特異性，在不同組織、不同發育階段中表達水平有顯著差異，是調控其他功能基因表達的重要分子［5］。本實驗旨在研究miR-200b基因啟動子區異常甲基化的程度與基因表達量的關系，及基因甲基化作用對胃癌MGC-803細胞增殖、侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 GES-1細胞購自北京腫瘤細胞庫，MGC-803細胞購自中國科學院上海生科院細胞資源中心。甲基化作用抑制劑5-氮雜胞苷（5′-Aza-CdR）購自美國Sigma公司，TRIZOL試劑購自美國Ambion公司，dNTP mixture、反轉錄酶（MMLV）、RNase抑制劑購自大連TaKaRa公司，熒光定量miRNAPCR試劑盒、逆轉錄引物及RT-PCR引物購自上海吉瑪公司。NI-細胞基因組DNA提取試劑盒，處理、純化回收DNA的EpiTect Bisulfite kit，No.59104試劑盒購自QIA?GEN公司，pMD?18-T Vector Cloning Kit購自大連TaKaRa公司。細胞凋亡檢測采用南京凱基公司Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒，Matrigel購自美國BD公司，E-cadherin、N-cadherin、ZEB1、Slug、基質金屬蛋白酶（MMP）9單克隆抗體均購自美國Cellsignal公司，相應二抗均購自中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與分組處理 GES-1、MGC-803細胞接種于含10%胎牛血清（56℃水浴滅活40min）DMEM高糖培養基中，在37℃含有5%CO2的濕潤空氣恒溫密閉式培養箱中培養，實驗時細胞處于對數生長期。第一部分：驗證miR-200b 在GES-1、MGC-803細胞中的表達量差異。第二部分：用不同濃度5′-Aza-CdR（2.5、5、7.5、10 μmol/L）作用胃癌MGC-803細胞72 h后，檢測miR-200b表達量差異，并選擇miR-200b升高較明顯所對應藥物濃度作為處理組進行下一步實驗，對照組為相同條件下空白對照。第三部分：驗證miR-200b表達量差異在調節增殖、侵襲、上皮間質轉化中的作用。

1.2.2 RNA提取及實時熒光定量PCR法檢測miR-200b表達量變化 TRIZOL法提取生長狀態良好的GES-1和處理前后的MGC-803細胞總RNA，依照試劑盒說明書配置逆轉錄反應體系，所用引物為特異miR-200b逆轉錄引物以及內參U6逆轉錄引物，得到cDNA，逆轉錄條件：95℃5 min，37℃1 h。以逆轉錄產物cDNA為模板進行PCR反應，檢測miR-200b表達量變化。PCR反應條件：預變性95℃ 5min，95℃ 30s，62℃ 30s，共40個循環，得出各組Ct值，所得結果按照2-ΔΔCt法進行計算。

1.2.3 亞硫酸氫鈉修飾測序PCR（BSP）法檢測miR-200b基因啟動子區甲基化水平變化 用NI-細胞基因組DNA提取試劑盒提取GES-1、MGC-803細胞系基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。使用QIAGEN（EpiTect Bisulfite kit，No.59104）試劑盒處理、純化回收DNA并作為模板，設計并驗證合成引物4對進行PCR，從中優選1對引物，其特異性引物序列：上游5′-GTATTTAGAGGAAGATGAGATG-3′，下游5′-AACCTAACTTATTAATTAACCTAC-3′，產物372 bp。擴增條件為95℃ 5min，95℃ 40s、54℃ 40s、72℃ 50s，共40個循環，72℃ 10min，產物回收后使用TaKaRa（pMD?18-T Vector Cloning Kit）連結、轉化大腸桿菌DH5α，搖菌后涂板（加Amp的LB固體培養基），做菌落PCR檢測，挑取陽性菌放入加有Amp的LB液體培養基搖菌，過夜后測序。使用BiQAnalyzer軟件對測序結果進行CpG島甲基化水平分析。

1.2.4 細胞凋亡測定 選擇生長在直徑為60 mm培養皿中MGC-803細胞系處理組和對照組，棄去培養基，PBS清洗2次，用不含EDTA的胰酶消化收集于EP管中，1 000 r/min離心5 min后棄去上清，PBS洗滌2～3次后收集細胞（1～5）×105個/mL，按說明書加入凱基凋亡試劑盒中試劑，室溫避光反應5～15 min，立即于real-tec流式細胞儀中于488 nm激發波長下檢測細胞凋亡情況。

1.2.5 細胞周期測定 選擇生長在6孔板中的MGC-803細胞系處理組和對照組，常規消化離心細胞，收集于EP管中，之后于EP管中加入約500 μL預冷的75%乙醇溶液，于4℃冰箱固定過夜，離心后棄去乙醇，PBS洗滌2次，加入300 μL PI溶液。避光染色20 min后，1 000 r/min離心5 min，棄去染料，PBS洗滌后于流式細胞儀488 nm波長下檢測各組細胞周期分布情況。

1.2.6 Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力 在8 μm小孔聚碳酸酯濾膜的培養小室上鋪用預冷無血清DMEM培養基稀釋的Matrigel機制膠（Matrigel∶DMEM=1∶2）30 μL，37℃培養箱內孵育待其凝固，接種150 μL無血清培養基稀釋MGC-803細胞約50 000個，下室加入500 μL含10%胎牛血清DMEM培養液，每組設3個復孔。37℃、5%CO2條件下培養48 h后，取出Transwell小室，棄去上室液體，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞，蘇木精染色5 min，PBS洗滌。DP-70熒光相差倒置顯微鏡（×100）采集圖像，隨機讀取3個視野，計算穿過膜的細胞數并取平均值。

1.2.7 Western-blot檢測細胞蛋白表達水平 分別收集對照組及處理組MGC-803細胞，用細胞裂解液RIPA裂解提取細胞總蛋白。SDS-PAGE凝膠電泳分離，恒壓80 V電轉移至PVDF印跡膜。膜封閉液封閉1 h后，加入一抗E-cad?herin、N-cadherin、ZEB1、Slug、MMP9、GAPDH（1∶1 000稀釋）4℃孵育過夜。次日室溫復溫30 min后PBST洗膜，用辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶1 000稀釋）室溫孵育1 h，凝膠成像系統采集成像。GAPDH蛋白作為內參。以目標蛋白條帶灰度值/同一樣本內參條帶灰度值計算目標蛋白相對表達量。以上實驗重復3次。

1.3 統計學方法 使用SPSS 11.0軟件進行分析，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，多組之間差異比較使用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗；2組間比較采用成組t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GES-1和MGC-803細胞miR-200b的表達水平 GES-1細胞中miR-200b表達高于MGC-803細胞（3.84±0.43 vs 1.98±0.29，t=6.709，P=0.022）。

2.2 不同濃度處理對MGC-803中miR-200b表達水平的影響 不同濃度（0、2.5、5.0、7.5、10 μmol/L）5′-Aza-CdR處理MGC-803細胞72 h后miR-200b表達量分別為1.00±0.00、2.35±0.39、2.28±0.26、3.36±0.01、5.98±0.63，差異有統計學意義（F=9.283，P＜0.01），以10 μmol/L升高較為顯著。

2.3 GES-1和MGC-803細胞miR-200b啟動子區甲基化差異 MGC-803中miR-200b啟動子區發生甲基化程度較GES-1顯著升高（［93.80±6.00）%vs （78.10±7.60）%，t=5.636，P=0.034］。

2.4 MGC-803處理組和對照組中miR-200b啟動子區甲基化差異 10 μmol/L 5′-Aza-CdR處理組細胞甲基化程度較對照組降低（［87.50±11.30）%vs （93.80±6.00）%，t=4.642，P=0.043］。GES-1和MGC-803對照組及處理組的miR-200b啟動子區甲基化位點圖，見圖1。

Fig.1 Methylation profiles around the transcriptional start site of miR-200b in GES-1 and MGC-803圖1 GES-1和MGC-803對照組及處理組的miR-200b啟動子區甲基化位點圖

2.5 去甲基化處理后MGC-803細胞凋亡水平變化結果 MGC-803處理組較對照組晚期細胞凋亡率增加（［5.25±0.32）%vs（3.52±0.18）%，t=9.636，P= 0.011］，見圖2。

Fig.2 Ratio of apoptotic cells in 5′-Aza-CdR treated and control MGC-803 cells圖2 處理組和對照組MGC-803細胞系凋亡率

2.6 去甲基化處理后 MGC-803細胞周期變化 MGC-803處理組較對照組q細胞大多被阻滯在G0/G1期，而G2/M期、S期的細胞數明顯減少（均P＜0.01），見圖3、表1。

Fig.3 Cell cycle profiles of MGC-803 after 5′-Aza-CdR treatment圖3 5′-Aza-CdR處理后的MGC-803細胞周期圖

Tab.1 The percentages of various cell phages in 5′-Aza-CdR treated and control MGC-803 cells表1 處理組和對照組MGC-803細胞在不同細胞周期的比例 （n=3，%，±s）

Tab.1 The percentages of various cell phages in 5′-Aza-CdR treated and control MGC-803 cells表1 處理組和對照組MGC-803細胞在不同細胞周期的比例 （n=3，%，±s）

＊＊P＜0.01

組別對照組處理組t G0/G1期56.44±1.64 67.63±1.89 19.580＊＊G2/M期9.32±0.15 12.91±0.21 4.532＊＊S期34.24±0.88 19.46±0.45 7.357＊＊

2.7 去甲基化處理后MGC-803細胞系侵襲能力變化 與對照組相比，處理組穿過小室的細胞數顯著減少，且每個視野的細胞數均少于對照組（［11.03± 0.93）個 vs（18.82±1.36）個，t=6.722，P=0.021］，見圖4。

2.8 MGC-803細胞上皮間質轉化（EMT）相關蛋白表達變化 處理組MGC-803細胞中E-cadherin蛋白相對表達水平較對照組明顯升高（P＜0.01），而N-cad?herin、ZEB1、Slug、MMP9較對照組明顯降低（P＜0.01），見圖5、表2。

Fig.4 The invasiveness of MGC-803 after 5′-Aza-CdR treatment圖4 5′-Aza-CdR處理MGC-803細胞后侵襲能力的變化（×100）

Fig.5 The protein expression levels of E-cadherin，N-cadherin，ZEB1，Slug，MMP9 in 5′-Aza-CdR treated and control MGC-803 cells圖5 MGC-803處理組及對照組中E-cadherin、N-cadherin、ZEB1、Slug、MMP9蛋白表達水平

Tab.2 Comparison of protein expression levels of E-cadherin，N-cadherin，ZEB1，Slug，MMP9 5′-Aza-CdR treated and control MGC-803 cells表2 MGC-803處理組及對照組中E-cadherin、N-cadherin、ZEB1、Slug、MMP9蛋白表達水平比較（n=3，±s）

Tab.2 Comparison of protein expression levels of E-cadherin，N-cadherin，ZEB1，Slug，MMP9 5′-Aza-CdR treated and control MGC-803 cells表2 MGC-803處理組及對照組中E-cadherin、N-cadherin、ZEB1、Slug、MMP9蛋白表達水平比較（n=3，±s）

＊＊P＜0.01

組別對照組處理組t E-cadherin 0.22±0.03 1.81±0.04 11.452＊＊N-cadherin 1.93±0.02 0.86±0.01 5.365＊＊ZEB1 1.58±0.01 0.64±0.05 6.941＊＊Slug 1.62±0.06 0.29±0.07 8.758＊＊MMP9 1.58±0.02 0.16±0.03 9.280＊＊

3 討論

3.1 基因異常甲基化的作用 異常DNA甲基化和組織蛋白乙?；潜碛^遺傳學修飾中最主要的兩部分，在基因致癌與抑癌研究中有重要作用［6］。其能在不改變DNA序列的前提下，改變生物的遺傳表象［7］。當基因發生異常甲基化時，常導致轉錄沉默，使重要基因如抑癌基因、DNA修復基因等喪失功能，從而導致正常細胞的生長分化調控失常以及DNA損傷不能被及時修復，這與多種腫瘤形成密切相關［8］。MiR-200b是長度僅有19～22 nt的核苷酸片段。本次研究證實miR-200b上游啟動子區有CpG島聚集區并且這些區域有甲基化現象存在，啟動子區發生甲基化后，影響基因正常轉錄和翻譯過程，導致其表達量降低；同時也可以在不同程度上增強腫瘤細胞MGC-803的侵襲性和增殖性。

3.2 5′-Aza-CdR的去甲基化作用 5′-Aza-CdR 是DNA甲基轉移酶（DNMT）的抑制劑，它可以和DNMT發生共價結合導致酶活性降低，進而影響甲基化發生率，并使由于甲基化原因導致沉默的基因重新表達。本研究證實5′-Aza-CdR可以部分逆轉miR-200b啟動子區的甲基化狀態，從而使由于異常甲基化作用導致的低表達狀態發生上調，進而降低胃癌MGC-803細胞的惡性侵襲與增殖性。

3.3 EMT的發生受miR-200b表達量的影響 EMT被認為是轉移性腫瘤形成的最早的步驟［9］，同時也是組織重新塑造的關鍵因素。EMT的特點是：代表上皮標志的指標（如E-cadherin）消失，而代表間充質標志的指標（如N-cadherin、ZEB1、Slug）上調［10］。研究表明，miR-200a的抑癌作用主要是通過抑制正常EMT，其具體機制是通過作用于其靶點ZEB1/ZEB2，降低對E-cadherin的抑制作用，促進E-cadherin高表達［11］。本研究證實，受不同程度甲基化影響的miR-200b表達量也可以影響EMT相關蛋白的表達。

本研究表明，miR-200b啟動子區高度甲基化狀態是導致其低表達的主要原因，而在DNA甲基轉移酶抑制劑的作用下，可使低表達量的miR-200b發生上調。對于在胃癌細胞MGC-803中充當抑癌基因的miR-200b來說，其甲基化狀態的不同會直接影響其表達量，進而間接影響其抑癌作用，導致MGC-803的惡性增殖和侵襲性發生改變，并影響EMT相關蛋白的表達。因此，基因異常甲基化的相關研究在腫瘤的發生、發展、預防及治療方面具有重要意義。

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（2014-11-12收稿 2015-01-21修回）

（本文編輯 李鵬）

Methylation of miR-200b and its effects on proliferation，invasion of gastric cancer cell line MGC-803

GUO Rong，NING Xianghong，JIANG Kui，ZHANG Qingyu△
Department of Gastroenterology，Tianjin Medical University General Hospital，Tianjin 300052，China
△Corresponding Author E-mail：zhangqy@tijmu.edu.cn

Objective To investigate the effect of expression level and methylation level of miR-200b on proliferation，invasion and apoptosis of gastric cancer cell line MGC-803 in vitro.Methods Normal human gastric epithelium cell line GES-1，and gastric cancer cell line MGC-803 cells were cultured and harvested to extract total RNA.Then miR-200b ex?pression level was examined via q-PCR；Methylation in promoter of miR-200b was revealed by Bisulphite PCR.MGC-803 cells were treated with different concentrations of 5′-Aza-CdR to test its effect on miR-200b expression and methylation of its promotor.The effect of its treatment at 10 μmol/L for 72 h on invasion，proliferation and apoptosis of both cell lines were detected by Transwell assay，Flow cytometry and apoptosis assay respectively.The gene related to EMT（epithelial-mesen?chymal transition）such as E-cadherin，N-cadherin，ZEB1，Slug were checked by Western blot.Results The expression of miR-200b in GES-1 is higher than that in MGC-803（P=0.022）.The methylation level in promoter region of miR-200b in GES-1 is lower than that in MGC-803（P=0.034）.After treated with 5′-Aza-CdR，the expression of miR-200b in MGC-803 cell was up-regulated in a timely dependent manner.On the contrary，the methylation in promoter of mirR-200b were down-regulated when 5′-Aza-CdR were added at 10 μmol/L（P=0.043）.What's more，5′-Aza-CdR administration increas?es cell apoptosis especially in aged cells and delays cell cycle at G0/G1which in turn decrease ratio of cells in S phages.5′-Aza-CdR treatment also decreased invasiveness and induced expression of E-cadherin，as well as down regulated the ex?pressions of N-cadhrin，ZEB1，Slug and MMP9 in MGC-803 cells.Conclusion Expression of miR-200b could be affected by methylation of promoter of miR-200b and in turn regulate proliferation and invasion of gastric cells in vitro.

stomach neoplasms；adenocarcinoma；cell apoptosis；cell proliferation；DNA methylation；microRNA-200b

R735.2，R349.6

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.04.002

國家自然科學基金資助項目（81172356）；天津市自然科學基金重點項目（10JCZDJC18500）

天津醫科大學總醫院消化內科（郵編300052）

郭蓉（1987），女，碩士在讀，主要從事胃癌發病機制研究

△E-mail：zhangqy@tijmu.edu.cn