鹽酸利多卡因葡聚糖基納米類脂質體的透皮研究

牛嬌，曾東，李芹，王生，常津，王悅，張連云△

實驗研究

鹽酸利多卡因葡聚糖基納米類脂質體的透皮研究

牛嬌1，曾東1，李芹2，王生3，常津3，王悅1，張連云1△

目的 探討采用葡聚糖基納米類脂質體為載體包載利多卡因（LID-HLD-BNs）的表面麻醉劑的體外透皮性能及在體透皮特征。方法 以包載利多卡因的傳統脂質體（LID-CLs）和鹽酸利多卡因注射液（LID-IJ）為對照，使用離體小鼠腹部皮膚，采用Franz擴散池，高效液相色譜法進行體外透皮實驗，觀察LID-HLD-BNs的透皮性能。以鈣黃綠素為探針，運用激光共聚焦顯微鏡（CLSM），以載鈣黃綠素的傳統脂質體（鈣黃綠素-CLs）和游離鈣黃綠素為對照，觀察該類脂質體制劑（鈣黃綠素-HLD-BNs）在活體小鼠腹部的熒光透皮情況。結果 LID-HLD-BNs單位面積累積透皮量和透皮速率高于LID-CLs和LID-IJ。LID-IJ、LID-CLs、LID-HLD-BNs的透皮速率分別為39.15、79.04和142.86 μg（/cm2·h），差異有統計學意義（P＜0.01）。在體熒光透皮實驗中，鈣黃綠素-HLD-BNs組的透皮速度和透皮深度均明顯大于鈣黃綠素-CLs組和游離鈣黃綠素組。結論 葡聚糖基納米類脂質體具有良好的經皮滲透性能。

投藥，皮膚；脂質體；利多卡因；色譜法，液相；藥物利用；體外研究

經表面涂布、透皮滲透產生滿意的麻醉效果，是口腔醫師高度關注的研究課題。局麻藥物透皮滲透的量及速率是影響局麻效果的重要因素。為此，國內外學者進行了許多研究和探索，如采用理化促滲方法、幾種麻醉藥物制成復合制劑以及將局麻藥載入滲透性強的載體等［1］，其中應用安全、穩定、滲透性高的脂質體載體透皮是目前研究的熱點之一［2］。類脂質體以非離子型表面活性劑代替傳統脂質體中易氧化的磷脂［3］，不但具有傳統脂質體的優點而且更加穩定。鹽酸利多卡因（LID）是臨床上常用的口腔局麻藥物，理化性質穩定、起效快、毒性小，但滲透性差、表面麻醉效果不理想［4］。本實驗采用賴氨酸、亞油酸、葡聚糖代替磷脂和膽固醇合成的葡聚糖類納米類脂質體包載鹽酸利多卡因（LID-HLD-BNs），以包載利多卡因的傳統脂質體（LID-CLs）和鹽酸利多卡因注射液（LID-IJ）為對照，通過動物離體和在體透皮實驗，評價其經皮滲透性能，探討其作為口腔表面麻醉藥的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀（美國Agilent公司），RYJ-6A型藥物透皮擴散實驗儀（上海黃海藥檢儀器有限公司），激光掃描共聚焦顯微鏡（CLSM，德國Bruker公司），CM-1900型冰凍切片機（德國LeiCa公司）。

1.1.2 實驗試劑 LID-HLD-BNs（粒徑54.1 nm），LID-CLs（粒徑250 nm），天津大學材料學院納米生物技術研究所實驗室在同一條件下合成，LID含量2%；LID-IJ，0.02 g/L，LID含量2%，批號20110312，上海禾豐制藥有限公司；HLD-BNs包載鈣黃綠素及CLs包載鈣黃綠素，均是0.05%（W/W），天津大學材料學院納米生物技術研究所實驗室合成［5］。

1.1.3 實驗動物 SPF級昆明種小鼠，5周齡，雌雄不拘，體質量（20±2）g，購自天津醫科大學實驗動物中心。

1.2 高效液相色譜法（HPLC）的建立 色譜條件［6］為色譜柱：Agilent zorbax SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相條件：甲醇∶0.01 mol/L磷酸二氫鈉（3∶1，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35℃；檢測波長：260 nm；進樣量：20 μL。在上述色譜條件下測定，該HPLC檢測方法的專一性良好，在本色譜條件下，LID峰形良好，無雜質峰干擾。得到LID的標準曲線方程為=0.051X-2.701，r=0.999 9，在0.5～500 mg/L之間線性關系良好。日內精密度為0.88%～1.01%，日間精密度為0.85%～1.35%?；厥章蕿?9.5%～102.2%。

1.4 在體熒光標記透皮研究 （1）實驗分組：按干預方式不同分為游離鈣黃綠素組（陰性對照）、鈣黃綠素-CLs組（陽性對照）和鈣黃綠素-HLD-BNs組，每組9只小鼠。實驗前1 d腹部去毛。（2）在體熒光標記透皮實驗：小鼠以戊巴比妥鈉麻醉后仰臥固定，避光于下腹部中央均勻涂抹藥物0.15 mL。給藥后0.5、1.0、1.5 h處死（每個時間點每組小鼠3只），取給藥區中央約1 cm2皮膚縱向切片［7］，切片厚度5 μm，激光共聚焦顯微鏡分析。儀器參數設置為最大激發波長和發射波長為Excitation Beam Splitter FW TD 488/543/633 nm，20×ob?jective，PMT 700 V，Zoom 2.81，Pinhole 1.88 airy。

1.5 統計學方法 采用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析，對3組藥物各時間點單位面積累積透皮量Q進行重復測量方差分析，對透皮速率進行單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 體外透皮實驗 3組藥物單位面積LID累積透皮量隨作用時間增加逐漸增加，15 min～12 h中，累積透皮量總體趨勢LID-HLD-BNs＞LID-CLs＞LIDIJ，見圖1。3組藥物的透皮速率間差異有統計學意義（P＜0.01），見表1。

Fig.1 Curve of cumulative transdermal quantity-time of LID in three groups圖1 3組藥物單位面積LID累積透皮量-時間（Q-t）曲線

Tab.1 Regression equation of transdermal quantity with time in three groups表1 3組藥物單位面積LID累積透皮量與時間的回歸方程

2.2 在體熒光透皮實驗 游離鈣黃綠素組在0.5、1.0、1.5 h時，熒光僅局限于角質層表面，說明游離鈣黃綠素并不能透過角質層。0.5 h時，鈣黃綠素-CLs組熒光局限于角質層，而鈣黃綠素-HLD-BNs組已透過角質層；1.0 h時，鈣黃綠素-CLs組熒光穿過表皮的1/5，鈣黃綠素-HLD-BNs組達到1/3；1.5 h時，熒光透過鈣黃綠素-CLs組表皮的1/3，而鈣黃綠素-HLD-BNs組熒光透過表皮全層，且顯示較強的熒光強度，見圖2。

3 討論

3.1 新型脂質體良好的透皮性能 LID-HLD-BNs為合作實驗室采用葡聚糖基新型納米類脂質體包載鹽酸利多卡因而成，相比較傳統脂質體，葡聚糖基類脂質體粒徑更小，帶有更多的正電荷，穩定性更好。LID-CLs和LID-HLD-BNs均具有兩親性，故均能透過皮膚表面，而LID-HLD-BNs具有更小的粒徑（僅54.1 nm），明顯小于LID-CLs（250 nm），其滲透速度及滲透量明顯大于LID-CLs。另外，生理條件下，皮膚黏膜表面呈負電荷，故帶正電荷的脂質體易與皮膚黏膜表面結合［8］。LID-HLD-BNs表面正電荷更多，與皮膚表面親和力更強。

3.2 體外和在體透皮實驗的聯合應用 目前Franz擴散池廣泛應用于藥物的體外透皮滲透實驗，可以比較形象地模擬藥物在生物體內的釋放情況，對臨床應用具有重要意義［9］。本研究建立的HPLC色譜方法專一性好，HLD-BNs、空白透皮液對LID檢測均無影響，可精確定量檢測皮膚滲透性實驗中LID的透過量。3組藥物單位面積的累積透皮量Q：LID-HLD-BNs＞LID-CLs＞LID-IJ，LID-HLD-BNs的滲透速率分別是LID-IJ、LID-CLs的3.65倍和1.81倍。近年來，CLSM作為一種新型的透皮分析技術開始應用于藥物的透皮給藥研究，CLSM能應用于藥物對活體組織的透皮研究，并使藥物透皮過程可視化［10-11］。鈣黃綠素與LID均為水溶性，文獻報道其可作為透皮研究的熒光標志物［12］，因此本研究用其代替LID來研究該體系的透皮滲透情況，結果顯示鈣黃綠素-HLD-BNs組各時間點熒光深度和熒光量均大于鈣黃綠素-CLs組，證明無論透皮深度還是透皮量，葡聚糖基類脂質體均具有一定優勢。

綜上所述，與包載利多卡因的傳統脂質體及利多卡因注射液相比，包載利多卡因的葡聚糖基納米類脂質體具有更優越的透皮性能，可有效增加藥物的透皮量和滲透深度，從而提高表面麻醉效果，為口腔臨床無痛治療提供良好的前景。

（圖2見插頁）

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（2014-10-24收稿 2014-12-30修回）

（本文編輯 李鵬）

Percutaneous permeability of lidocaine hydrochloride loaded destran-based niosomes

NIU Jiao1，ZENG Dong1，LI Qin2，WANG Sheng3，CHANG Jin3，WANG Yue1，ZHANG Lianyun1△
The Stomatological Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China
△Corresponding Author E-mail：zhly@tijmu.edu.cn

Objective To study the percutaneous permeability through mouse skin of lidocaine hydrochloride-loaded destran-based niosomes（LID-HLD-BNs）in vitro and in vivo.Methods HPLC was employed to exam lidocaine hydrochlo?ride.Lidocaine hydro-chloride-loaded conventional liposomes（LID-CLs）and lidocaine hydrochloride injection（LID-IJ）were used as control.Isolated mouse skin was added into Franz diffusion cell to evaluate the permeability of LID-HLD-BNs in vitro.Confocal Laser Scanning Microscopy（CLSM）was used to observe the permeation depth of mouse skin in vivo.Re?sults The permeation rate and cumulative permeation amount were significantly higher in LID-HLD-BNs group than those of LID-CLs and LID-IJ groups（P＜0.05）.CLSM studies also confirmed that HLD-BNs reached deeper layers of the skin.Conclusion LID-HLD-BNs has good transdermal ability.

administration，cutaneous；liposomes；lidocaine；chromatography，liquid；drug utilization；in vitro

R943.43

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.04.005

國家自然科學基金資助項目（81070871）；天津市自然科學基金重點項目（11JCZDJC20400）

1天津醫科大學口腔醫院（郵編300070）；2天津醫科大學基礎學院藥理學教研室；3天津大學材料科學與工程學院納米生物技術研究所

牛嬌（1988），女，碩士在讀，主要從事表面麻醉劑研究

△E-mail：zhly@tijmu.edu.cn