黃連素對乳腺癌MCF-7細胞增殖和凋亡的影響

張亞軍，錢立庭，陳昌杰

黃連素對乳腺癌MCF-7細胞增殖和凋亡的影響

張亞軍1，2，錢立庭1，陳昌杰3

目的 研究黃連素對人乳腺癌細胞株MCF-7的增殖和凋亡的影響以及機制。方法 用不同濃度的黃連素（0、10、20、40）g/ml處理人乳腺癌細胞株MCF-7，細胞培養72 h后，MTT法檢測MCF-7細胞增殖抑制率;流式細胞術檢測MCF-7細胞凋亡的影響;Western blot法檢測JAK2、p-JAK2、p-STAT3、STAT3、Bax、Bcl-2、Cleavage-PARP 和 Cleavage-Caspase3表達。結果 黃連素呈濃度依賴性地誘導MCF-7細胞的增值抑制和凋亡，上調Bax、Cleavage-PARP和Cleavage-Caspase3表達，下調 p-JAK2、p-STAT3和 Bcl-2，對 JAK2和STAT3表達無明顯影響。但高表達p-STAT3的MCF-7細胞可以抑制黃連素的減少增殖和促進凋亡作用。結論 黃連素誘導MCF-7細胞增殖抑制和凋亡的機制可能是通過調節JAK2/STAT3信號通路。

黃連素;MCF-7;增殖;凋亡;JAK2/STAT3

乳腺癌是我國常見的惡性腫瘤之一，嚴重影響女性健康［1］。目前乳腺癌主要選擇手術、放療和化療等，但治療創傷大且并發癥多［1－2］。因此尋找有效、低毒、副作用小的治療乳腺癌的方案成為緊迫而現實的問題。傳統中國草本藥物有廣泛的生物和藥用價值，已經應用數千年，具有有效、安全性高、易獲取、低價格等特性，所以近20年來尋求傳統中藥用于腫瘤治療和預防的研究成為熱點。黃連素是從黃連、黃柏、血紅小檗等植物的根莖中分離提取出來的天然生物堿，有抗氧化效應和多種藥理特性。研究［3－7］表明（包括體內和體外研究），黃連素對骨肉瘤、肺癌、膀胱癌、前列腺癌、肝癌、結直腸癌、乳腺癌、白血病都有一定的抗腫瘤作用，而且研究［8］顯示黃連素對人體正常細胞沒有毒性。黃連素抗腫瘤的機制主要與抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤血管生長和延遲腫瘤細胞的轉移有關［9］。而乳腺癌的發病機制是增殖過度和凋亡受阻［1－2，10］。該研究以人乳腺癌細胞株 MCF-7 為靶細胞，探討黃連素對乳腺細胞株MCF-7作用及機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 人乳腺癌細胞株MCF-7購自美國組織培養庫（ATCC）;黃連素購自陜西賽德高科技生物股份公司，經高效液相色譜儀（HPLC）鑒定純度超過95%，分子式為C20H18ClNO4;CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所;Annexin V-FITC凋亡試劑盒購自美國Abcam公司;RPMI 1640細胞培養基購自美國Gibgo公司;小牛血清購自中國浙江天杭生物科技公司;12孔培養板購自美國BD法康公司;β-actin抗體購自中國艾比瑪特公司;Bcl-2抗體、Bax抗體、Cleavage-PARP、Cleavage-Caspase3 購自美國 Santa Cruz公司;JAK2抗體、p-JAK2抗體、STAT3抗體、p-STAT3抗體購自美國CST公司;人p-STAT3小干擾RNA（siRNA）和對照組siRNA均購自美國Santa Cruz公司;Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司;蛋白裂解液RIPA、BCA蛋白定量試劑盒購自武漢碧云公司;cocktail蛋白酶抑制劑及Western blot凝膠配制試劑盒購自中國谷歌生物科技公司。

1.2 細胞培養 以適量濃度的MCF-7細胞分別接種于含有10%小牛血清RPMI 1640細胞培養液中，再加入濃度為100 U/ml的青霉素和濃度為100 U/ml的鏈霉素;在37℃恒溫、5%CO2飽和濕度培養箱中培養。高表達p-STAT3的MCF-7細胞是用包含pRC/CMV-vecto或pRC/CMV-STAT3C-標記的質粒利用Lipofectamine 2000轉染獲得。

1.3 儀器 二氧化碳細胞培養箱和酶標儀均購自美國賽默飛世爾科技公司;倒置顯微鏡、激光掃描共聚焦熒光顯微鏡均購自日本Olympus公司;PVDF膜購自美國羅氏公司;ECL試劑盒購自美國Bi-pech公司;膠片及化學發光儀購自美國Kodak公司。

1.4 MTT檢測細胞增殖 將處于對數生長期MCF-7細胞，以濃度為1×105/ml加入12孔板內，每孔 90 μl;加入黃連素 0、10、20、40 g/ml，劑量參考文獻［5］，每個濃度設3個復孔。置12孔板于恒溫37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養48 h，每孔加入MTT溶液20 μl;繼續在培養箱中培養4 h，終止培養，然后每孔加入三聯裂解液100 μl溶解，避光放入37℃恒溫培養箱中孵育過夜。用酶標儀在波長為570 nm處測定吸光度（optical density，OD）值，試驗重復3次;根據OD值計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率（%）=（對照孔OD值－實驗孔OD值）/（對照孔OD值－空白孔OD值）×100%。

1.5 Annexin-V雙染法檢測細胞凋亡 將處于對數生長期的細胞以濃度1×105/ml加入6孔板中，細胞培養24 h后;收集各組所有懸浮細胞，調整細胞密度1 ×105/ml，每孔90 μl。加入黃連素（0、10、20、40 g/ml），收集1 ml細胞懸液，轉入離心管，1 000 r/min離心5 min;棄去培養基，加RNA酶，37℃水浴1 h;放入冰浴，然后分別加入碘化丙啶（PI）及Annexin V，輕輕搖勻后避光放置。隨即進行流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，分析軟件采用 CELIQUEST。

1.6 Western blot檢測各組細胞 JAK2、p-JAK2、p-STAT3、STAT3、Bax、Bcl-2、Cleavage-PARP 和Cleavage-Caspase3表達 將各濃度組收集的細胞用預冷的PBS清洗后，根據蛋白裂解液RIPA操作說明書進行蛋白質提取。采用BCA法進行蛋白質定量測定，將各組蛋白濃度調成一致，煮沸5 min使蛋白質變性后待用。取各組細胞總蛋白樣品80 μg，以樣品中的β-actin為內參，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉膜。轉膜結束后，將膜取出后進行標記，然后用含5%脫脂奶粉的PBS封閉2 h分別加入適量含2%脫脂奶粉的PBS稀釋JAK2抗體（1∶1 000），p-JAK2（1 ∶500），STAT3（1 ∶1 000），p-STAT3（1 ∶500），Bax（1 ∶500），Bcl-2（1 ∶500），Cleavage-PARP（1∶500）和 Cleavage-Caspase3（1 ∶500），表達 β-actin（1∶3 000）抗體，4℃避光過夜孵育，結束后用PBS沖洗膜3次，每次10 min。根據一抗來源的不同，然后再加入含2%脫脂奶粉的PBS稀釋的HRP標記羊抗兔IgG（1∶500）、HRP標記羊抗鼠IgG（1∶5 000）室溫下搖床孵育2 h，結束后用PBS沖洗膜3次，每次10 min，ECL發光試劑盒化學發光顯色、壓片、顯影、定影、膠片拍照掃描保存。用Ge-l Pro Analy zer（Ver 3.0）軟件測定蛋白條帶灰度值，分析計算 JAK2、p-JAK2、p-STAT3、STAT3、Bax、Bcl-2、cleavage-PARP 和 cleavage-Caspase3與β-actin內參條帶灰度值的比值，將上述蛋白表達量化。

1.7 質粒轉染和干擾 MCF-7細胞利用質粒和LipofectamineTM2000，轉染高表達激活形式的 p-STAT3，使MCF-7細胞高表達p-STAT3;在轉染24 h后，將高表達p-STAT3的MCF-7細胞分別用黃連素和培養基。72 h后利用MTT和凋亡試劑盒測增值和凋亡。MCF-7利用 siRNASTAT3和 LipofectamineTM2000，沉默 STAT3，使 MCF-7細胞低表達STAT3，在轉染24 h后，將低表達p-TAT3的MCF-7細胞分別用黃連素和培養基，72 h后利用MTT和凋亡試劑盒測增殖和凋亡。

1.8 統計學處理 采用SPSS 12.0軟件進行分析，數據以±s表示;兩樣本均數比較采用t檢驗，多組間數據比較采用方差分析。

2 結果

2.1 黃連素對MCF-7細胞增殖的影響 MTT檢測實驗結果顯示，黃連素可以呈濃度依賴性抑制MCF-7細胞增殖，在40 μg/ml達到最大抑制率（P＜0.05）。見圖1。

2.2 黃連素對MCF-7細胞凋亡的影響 流式細胞術檢測實驗結果顯示，黃連素可以呈濃度依賴性促進MCF-7細胞凋亡（F=165，P＜0.05）。Western blot顯示，黃連素可以促進Bcl-2的降解（F=109，P＜0.05）和上調 Bax、Clevage-Caspase3和 Clevage-PARP 的表達（F=143、126、109，P＜0.05）。見圖2、3。

2.3 黃連素對 MCF-7細胞 JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3表達的影響 Western blot顯示，黃連素可以呈濃度依賴性促進p-JAK2、p-STAT3表達下調（F=113、102，P＜0.05），但對 JAK2、STAT3表達無明顯影響（F=6.0、3.2）。顯示黃連素可以抑制MCF-7細胞JAK2/STAT3的激活。見圖4。

2.4 黃連素通過抑制JAK2/STAT3信號通路誘導MCF-7增殖抑制和凋亡 在MCF-7細胞利用質粒高表達p-STAT3可以抑制黃連素對MCF-7細胞的增殖抑制和凋亡（F=108、156，P＜0.05）。在MCF-7細胞利用siRNA沉默STAT3表達，可以增強黃連素對MCF-7細胞的增殖抑制和凋亡（F=117、128，P＜0.05）。見圖5。

3 討論

祖國醫學博大精深，從祖國醫學寶庫中挖掘出可以抑制乳腺癌惡性增殖的方法是研發高效低毒抗癌藥的有效途徑之一。黃連素是一種從許多藥用植物中分離出來的異喹啉類生物堿，其具有抗氧化作用及多種藥理學特性，臨床上一直用于清熱解毒和治療腹瀉［9］。黃連素誘導細胞凋亡并抑制細胞增殖的的作用在乳腺癌、肺癌、結腸癌和肝癌來源的多種細胞系中都得到了證明［10－12］。黃連素同時也調節一些信號傳導途徑，細胞因子刺激信號可以通過多條細胞通路傳入到細胞內，引導細胞對環境刺激做出反應，然后協調和適應;JAK-STAT信號通路是在信號傳導中起著重要作用，與免疫調節、細胞生長、增殖、分化和凋亡密切相關［13－14］。目前研究［15－16］表明JAK-STAT信號通路在乳腺癌細胞增殖和凋亡調控方面扮演著十分重要的角色。

本試驗顯示黃連素可以呈濃度依賴性的誘導MCF-7細胞的增殖抑制和凋亡，上調Bax、cleavage-PARP和 cleavage-Caspase3的表達，下調p-JAK2、p-STAT3和Bcl-2，但對JAK2和STAT3表達無明顯影響。為了進一步證實黃連素誘導乳腺癌細胞增殖抑制和凋亡受阻是通過JAK2/STAT3信號通路，利用質粒和小干擾RNA分別高表達和低表達p-STATA3和STAT3，實驗結果顯示高表達p-STAT3的MCF-7細胞與未轉染的MCF-7細胞相比，黃連素誘導的增殖抑制和凋亡明顯減少;低表達STAT3的MCF-7細胞與未干擾的MCF-7細胞相比，黃連素誘導的增殖抑制和凋亡明顯增強，這顯示黃連素誘導MCF-7細胞增殖抑制和凋亡的機制可能是通過調節JAK2/STAT3信號通路。

綜上所述，黃連素誘導MCF-7細胞增殖抑制和凋亡的機制可能是通過調節JAK2/STAT3信號通路。但是黃連素作用機制仍不清楚，可能系直接作用于JAK2信號分子或者通過調節其上游激酶和/或信號分子而發揮著間接作用。黃連素在乳腺癌中的定義、潛在應用及作用靶點仍然是一個重要的問題。更好地理解黃連素調控的細胞通路，無疑將能更好地理解其在乳腺癌的發病機理和治療方面的應作用，將會進行進一步更深入的研究，探討是否其他信號通路調控黃連素誘導MCF-7細胞增殖抑制和凋亡。

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Effect of berberine on proliferation and apoptosis of MCF-7 cells

Zhang Yajun1，2，Qian Liting1，Chen Changjie3
（1Dept of Radiation Oncology，Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei230001;2Dept of Radiation Oncology，The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu233004;
3Dept of Biochemistry＆Molecular Biology，Bengbu Medical College，Bengbu233030）

ObjectiveTo investigate the effect and mechanisms of the Berberine on the human breast adenocarcinoma cell line MCF-7.MethodsMTT method was used to evaluate the proliferation effect of MCF-7 and the percentage of apoptotic cells were determined by flow cytometric analysis.The expressions of JAK2，p-JAK2，p-STAT3，STAT3，Bax，Bcl-2，Cleavage-PARP and Cleavage-Caspase3 were detected by Western blotting.ResultsThe results showed that BBR treatment decreased the activation of JAK2/STAT3 signal pathway and up-regulated the expression of Bax，Caspase3 and PARP activation with the decrease of the expression of Bcl-2.Wherefore，expression of the constitutively active form of STAT3 could attenuate the effect of BBR on the MCF-7 cell.ConclusionBerberine can induces apoptosis and proliferation inhibition of breast adenocarcinoma cell lines of MCF-7 through inhibition of the JAK2/STAT3 signaling pathway.

berberine;MCF-7;proliferation;apoptosis;JAK2/STAT3

R 739.9

A

1000－1492（2015）09－1276－05

2015－05－18接收

安徽高校省級科學研究項目（編號:KJ2013A184）

1安徽醫科大學附屬省立醫院腫瘤放療科，合肥 2300012蚌埠醫學院第一附屬醫院腫瘤放療科，蚌埠 2330043蚌埠醫學院生化與分子生物學教研室，蚌埠 233030

張亞軍，男，副主任醫師;

錢立庭，男，博士，教授，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail:money2004@sina.com