大腸桿菌噬菌體的研究進展

吳偉勝+李玉保+王守榮等

摘要： 大腸桿菌病為畜牧養殖業常見疾病之一，目前臨床上主要依賴于抗生素進行控制。隨著大腸桿菌耐藥性增強以及人們對食品安全意識的提高，急需尋找安全、高效的抗生素替代品。噬菌體是能夠感染細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒總稱，具有巨大的潛在應用價值。對近幾年國內外有關大腸桿菌噬菌體的分布、分離純化方法、保存方法、形態、pH值穩定性、溫度穩定性、分子生物學以及應用方面作了簡要概述，并對以后的科研和應用進行了思考和展望。

關鍵詞： 大腸桿菌；噬菌體；研究進展

中圖分類號：S852.61+2 文獻標志碼： A[HK]

文章編號：1002-1302（2015）08-0008-03

近年來，由于畜牧養殖業大量使用抗生素，導致病原微生物的耐藥性升高 [1]，同時，抗生素的使用對食品安全構成威脅。噬菌體作為一類能夠感染和裂解大腸桿菌等微生物的病毒，具有宿主專一、不產生耐藥性 [2]、使用安全 [3-4]等優勢，在美國已應用于兒童腹瀉疾病的治療 [5]。因此，噬菌體有望在防控畜牧業腸道性疾病中替代抗生素。本文對近幾年國內外關于大腸桿菌噬菌體的分離和保存方法、生物學特性等進行綜述，希望能夠對大腸桿菌噬菌體更深入的研究和應用提供思路和方法。

1 大腸桿菌噬菌體的分布

目前研究發現的病毒種類數量龐大，其中大部分是噬菌體 [6]。大腸桿菌噬菌體在我們生活的周圍環境中普遍存在。到目前為止，學者們已經從不同的樣品中分離出來多種大腸桿菌噬菌體，并對所分離的噬菌體進行了分類和命名。在養殖場的雞糞 [7-8]和污水中 [9]，以不同的大腸桿菌為宿主菌分離到不同種類的大腸桿菌噬菌體；在養豬場的糞便中，以產腸毒素性大腸桿菌K88 為宿主菌分離并純化了1株噬菌體PK88-4 [10]；在城市的污水中，以腸出血性大腸桿菌O157 ∶ H7為宿主菌分離出裂性噬菌體 [11]。此外，在醫院的污水中，用大腸桿菌E1～ E17共17種細菌做指示菌分離出1種廣譜噬菌體IME11 [12]。

2 大腸桿菌噬菌體的分離純化方法

對于噬菌體的分離純化，大致可以分為采樣、富集、分離、純化4個步驟。每個步驟又包含1種或多種不同的方法，可以根據自身的試驗條件和試驗狀況將不同方法組合，進而得到最佳的分離純化方法。

2.1 采樣

采樣大致可以分為直接法、間接法和誘導法 [13]3種。直接法是指直接從對象菌生活的生物體上采集樣本的方法。李灝等 [14]、Connerton [15]都采用直接法從發病雞的腸道中采樣并分別分離出大腸桿菌噬菌體和空腸彎曲桿菌噬菌體。間接法是指根據對象菌的特性，從相應的非生物壞境中采集樣本的方法。如從養雞場的污水、糞便和土壤中采樣進而分離噬菌體 [8-9，16-17]。誘導法是指用對象菌去感染生物體進而在生物體或其生活環境中采樣的方法。郭海萍等用痢疾志賀氏菌感染小鼠，采取小鼠的糞便進而分離得到相應噬菌體。

2.2 富集

富集也稱增殖，即將對象菌懸液與樣品液共同培養，增加樣品液中噬菌體的含量，富集之后的樣品液更易分離出噬菌體。郭秋菊等從生活污水中采樣分離噬菌體，進行了富集和不富集的對照試驗，結果顯示，富集之后的樣品很容易檢測到噬菌體，而不經富集的樣品未檢測到噬菌體 [19]。雖然不經富集的樣品中未檢測到噬菌體，但并不表示樣品中不含噬菌體。

2.3 分離

分離方法可以分為雙層瓊脂平板法、瓊脂平板涂布法、瓊脂平板傾注法3種 [13]。各種方法有自己的優缺點，學者們通常根據自己的試驗條件和操作習慣進行選擇。

2.4 純化

純化可以分為液體純化法和平板純化法 [13]。液體純化法中，用無菌槍頭或牙簽挑單個噬菌斑，然后接入含對象菌的液體培養基中進行適溫培養，再經過濾除菌即得到純化噬菌體 [20]。平板純化法中，也是用無菌槍頭或牙簽挑單個噬菌斑于緩沖液進行洗脫，洗脫液經適當稀釋后再用雙層瓊脂平板法、瓊脂平板涂布法或瓊脂平板傾注法進行培養，如此操作 3～5次，即可得到純化噬菌體 [10，19]。

3 大腸桿菌噬菌體的保存方法

在對噬菌體的保存方法上，研究學者們嘗試過很多種方法，不同的保存方法對噬菌體活性的保持影響很大。

陳萍等取3組500 μL噬菌體裂解液：第一組加入了 100 μL 氯仿，第二組加入500 μL LB液體培養基，第三組加入CaCl2和MgCl2至終濃度10 mmol/L、0. 1%明膠， 4 ℃ 保存1個月，結果顯示第三組噬菌體的活性很少降低，效價最高 [21]。

有很多關于-18 ℃保存噬菌體的研究。陳海陽將1株廣譜大腸桿菌噬菌體EX01裂解液放于-18 ℃低溫保存，每隔一周測定其效價，結果顯示噬菌體EX01在35 d時仍具有較高的效價，56 d時仍有感染性，63 d時感染性消失 [13]。郭秋菊等對比了在-18 ℃保存已純化的噬菌體平板或噬菌體懸液的2種方法。結果顯示，2種方法都能保存1個月以上，但平板保存法優于噬菌體懸液保存法 [19]。

另外報道顯示，T4-Like大腸桿菌噬菌體在10 mmol/L的鎂離子中，30 ℃保存超過1個月，效價都沒有降低 [22]。

4 大腸桿菌噬菌體的形態

噬菌體個體微小，不具有細胞的完整結構，只含有單一核酸。噬菌體按蛋白質結構可以分為無尾部的二十面體、有尾部的二十面體和線狀體3種。無尾部的噬菌體外表由蛋白外殼組成，核酸被包裹在內部。有尾部的噬菌體除了頭部外，還有尾部和基部：尾部由1個中空的針狀結構及外鞘組成，基部由尾絲和尾針組成。線狀體噬菌體沒有明顯的頭部結構，而是由殼粒組成的盤旋狀結構。

已知的噬菌體大多都是有尾部的二十面體。許多研究人員分別對從養殖場糞便中、河水中和污水中分離出的噬菌體進行了電鏡拍照，照片顯示噬菌體都由頭部和尾部組成，且頭部呈正多面體狀，直徑45～95 nm，尾部粗長、含有尾鞘，長100～120 nm [7，10-11，23-24]。

此外，郭秋菊等從生活污水中分離了3種類型的噬菌體，經電鏡拍照顯示：一種類型的噬菌體尾部不能收縮，頭部為二十面體，直徑110～120 nm，尾長220～230 nm，尾寬13～15 nm，沒有尾鞘、基板、尾丁、尾絲；一種類型的噬菌體尾部可以收縮，頭部為三十面體，直徑70～110 nm，尾長120～130 nm，尾寬18～22 nm，有尾鞘、基板、尾丁和尾絲結構；一種類型為短尾噬菌體，頭部直徑約20 nm，尾長2～3 nm [19]。

5 大腸桿菌噬菌體穩定性

5.1 pH值穩定性

噬菌體生長和其他微生物一樣，除了其他必要的生長條件外，還需要有適合其生長的pH值。在其他生長條件相同的情況下，pH值不同對噬菌體生長的影響也不同。何覓之將Bp9B1226噬菌體純培養液分別加入不同pH值（4、5、6、7、8、9、10、11）的LB液體培養基中，放于37 ℃恒溫水浴24小時，用雙層平板法測定噬菌體效價，結果顯示Bp9B1226噬菌體在pH值=6～9時，噬菌體效價指數無明顯變化，當pH值<5或pH值>10時，噬菌體效價指數明顯下降 [25]。另外，代保英對大腸桿菌噬菌體BpD的pH值的穩定性也做了類似的試驗，結果顯示：在pH值=5～9時，噬菌體BpD活性較高，尤其在pH值=7～8時，活性最高；在pH值<5或pH值>9時，活性明顯下降 [26]。由此看出，大腸桿菌噬菌體對pH值的適應范圍較廣。

5.2 溫度穩定性

溫度對噬菌體的感染力有很大影響，找到噬菌體保持感染力的溫度范圍，將會對進行噬菌體更深入的研究與應用起到關鍵作用。張培東等對大腸桿菌噬菌體Bp6的熱穩定性做了測定，他們將具有一定效價的噬菌體Bp6懸液分別經40、50、60、70、80、90 ℃水浴30 min和1 h，隨即將懸液冰浴冷卻測其效價，結果顯示噬菌體Bp6在40 ℃下作用30 min和 1 h 活性基本不變，50 ℃和60 ℃下作用 30 min 和1 h仍有較高活性，70 ℃下作用30 min和1 h基本失去活性，80 ℃和90 ℃下作用30 min和1 h完全失去活性 [7]。何覓之 [25]和代保英 [26]也分別對相應的大腸桿菌噬菌體做了類似試驗，結果顯示，噬菌體對溫度的穩定性比較高，但長時間處于70 ℃以上高溫，噬菌體的活性會迅速降低以至失去。

6 大腸桿菌噬菌體分子生物學

噬菌體所含的核酸可以分為4種：單鏈RNA（ssRNA）、雙鏈RNA（dsRNA）、單鏈DNA（ssDNA）和雙鏈DNA（dsDNA）。

在近幾年的研究中發現，多數大腸桿菌噬菌體的遺傳物質為DNA。尹雅菲等對分離出的1種寬譜噬菌體IME11做了遺傳物質的鑒定，他們分別用DNaseⅠ和RNaseA 處理噬菌體IME11的遺傳物質，證明噬菌體IME11的遺傳物質為DNA，并用限制性內切酶處理其遺傳物質，證明其遺傳物質為dsDNA [12]。同時，王冉等對分離出的1株噬菌體PK88-4也做了基因組分析及酶切鑒定，證明噬菌體PK88-4的遺傳物質為dsDNA，基因組大小約為60 kb [10]。

此外，有些關于大腸桿菌噬菌體的研究顯示，其遺傳物質為RNA。徐焰等對1株分離自醫院污水的寬宿主譜大腸桿菌噬菌體和1株單一宿主譜噬菌體f2進行了遺傳物質測定，結果顯示，寬宿主譜大腸埃希菌噬菌體和f2 噬菌體均為 6 000 bp 左右的單鏈RNA [27]。

7 大腸桿菌噬菌體的噬菌譜

根據噬菌體的噬菌譜不同，可以大致將噬菌體分為寬宿主譜噬菌體和專一宿主噬菌體。

寬宿主譜噬菌體是指能夠裂解多種宿主菌的噬菌體。徐焰等從醫院污水中分離出1株大腸桿菌噬菌體，經宿主范圍測定，發現該噬菌體可以裂解5株大腸桿菌，所以可以確定該噬菌體為大腸桿菌寬宿主譜噬菌體 [28]。此外，王禮偉等 [9]和杜崇濤等 [11]也分別從養雞場污水和城市污水中分離出了大腸桿菌寬宿主譜噬菌體。

專一宿主噬菌體是指只能夠裂解專一宿主菌的噬菌體。因其具有嚴格的宿主專一性，在細菌的檢測、細菌分型以及特異性裂解方面都有很強的優勢 [29]。

8 大腸桿菌噬菌體的安全性

[JP3]和抗生素相比，噬菌體不易造成細菌的抗性。相關性研究表明，細菌對噬菌體產生抗性的突變頻率為10 -7，產生抗性的幾率很小 [30]，而且噬菌體也可以為適應宿主菌產生適當的變異 [2]。

噬菌體在清除宿主菌的同時，也不會影響動物體內周圍的正常菌群。Chibani-Chennoufi等用4種大腸桿菌噬菌體飼喂小鼠，結果顯示噬菌體幾乎對正常菌群沒有影響 [31]。Bruttin等讓15個志愿者服用T4噬菌體，受試者均無不良反應，且沒有影響腸道內正常菌群 [3]。

9 大腸桿菌噬菌體的應用

噬菌體生物制劑在治療疾病中有很多的優勢：噬菌體的特異性強，能專一地裂解宿主菌，且不會破壞一些正常菌群；噬菌體的增殖周期比較短，產生子代噬菌體的數量大，對疾病的治療會更加快速有效；在噬菌體將病原菌裂解之后，噬菌體會隨著病原菌的清除而自動滅亡，不會殘留在動物體內 [32]。Tanji等用3株廣譜噬菌體做成混合制劑，用于裂解體外培養的E. coli O157：H7菌，結果顯示噬菌體混合制劑成功裂解了E. coli O157：H7 菌，同時又把混合制劑飼喂被E. coli O157：H7 感染的小鼠，小鼠腸道的E. coli O157：H7菌也被完全裂解 [33]。Smith等用噬菌體Φ9882治療經大腸埃希菌感染的小鼠，結果小鼠全部存活，而用生理鹽水的對照組小鼠全部死亡 [34]。Smith等用噬菌體B85/1、B85/2成功治愈了小牛大腸埃希菌引起的腹瀉 [35]。

10 展望

在抗生素使用泛濫的時代，耐藥菌株增長的速度也越來越快。噬菌體作為一種生物制劑，無疑會在畜禽疾病的防治上起到很好的作用。到目前為止，全國各地的科研人員和技術人員在大腸桿菌噬菌體方面做了大量的工作，并取得了可喜的成果。但是，噬菌體在臨床上的應用還有很漫長的科研之路。開發能對應相關疾病的噬菌體試劑或混合制劑，在某些情況下避免生物體內的非特異性免疫反應，這些都是擺在我們面前的難題。同時，由于噬菌體對宿主的高度特異性，尋找寬宿主譜噬菌體，研究噬菌體的溶壁酶都是我們努力的方向。相信在廣大科研技術工作人員的共同努力下，噬菌體一定能在畜禽疾病防治方面起到重要的作用。

參考文獻：

[1] 鄒 玲，唐 棟，劉文華，等. 雞致病性大腸桿菌噬菌體的分離[J]. 中國畜牧獸醫，2007，34（3）：103-104.

[2]王 盛，童貽剛. 噬菌體治療研究進展[J]. 微生物學通報，2009，36（7）：1019-1024.

[3]Bruttin A，Brüssow H. Human volunteers receiving Escherichia coli phage T4 orally：a safety test of phage therapy[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2005，49（7）：2874-2878.

[4]Borysowski J，Górski A. Is phage therapy acceptable in the immunocompromised host？[J]. International Journal of Infectious Diseases，2008，12（5）：466-471.

[5]dHerelle F. Bacteriophage as a treatment in acute medical and surgical infections[J]. Bulletin of the New York Academy of Medicine，1931，7（5）：329-348.

[6]Breitbart M，Rohwer F. Here a virus，there a virus，everywhere the same virus？[J]. Trends in Microbiology，2005，13（6）：278-284.

[7]張培東，孫 巖，任慧英，等. 大腸桿菌噬菌體的分離及其生物學特性[J]. 中國獸醫雜志，2008，44（4）：10-12.

[8]李 冰，唐 峰. 雞大腸桿菌噬菌體分離及裂解性試驗[J]. 中國家禽，2011，33（14）：63-64.

[9][JP2]王禮偉，梁 晏，屈勇剛，等. 一株雞源致病性大腸桿菌噬菌體的分離及其生物學特性[J]. 江蘇農業學報，2014，30（2）：455-457.

[10] 王 冉，韓 晗，張 輝，等. 大腸桿菌K88噬菌體的分離鑒定及其生物學特性[J]. 華北農學報，2012，27（4）：163-167.

[11]杜崇濤，王文東，劉 軍，等. 腸出血性大腸桿菌O157：H7噬菌體的分離純化[J]. 吉林畜牧獸醫，2008，29（4）：6-8.

[12]尹雅菲，張 樂，慶 宏，等. 新廣譜大腸桿菌噬菌體IME11的分離及鑒定[J]. 生物醫學工程與臨床，2013，17（5）：483-486.

[13]陳海陽. 大腸桿菌噬菌體的分離純化及其在海水養殖中的應用[D]. 廈門：廈門大學，2013：4-5.

[14]李 灝，謝慧君，孔 健，等. 畜禽腸道致病菌噬菌體的生物學特性研究[J]. 微生物學通報，2004，31（2）：10-13.

[15]Connerton P. Natural campylobacter control with bacteriphage[J]. World Poultry，2006，26（6）：25-26.

[16]趙 燕，任紅衛，孔 健，等. 噬菌體生態防治效果試驗初報[J]. 中國獸醫雜志，2005，41（3）：18-20.

[17]Huff W E，Rath N C，Balog J M，et al. Alternatives to antibiotics：utilization of bacteriophage to treat colibacillosis and prevent foodborne pathogens[J]. Poultry Science，2005，84：655-659.

[18]郭海萍，陳振輝，黃艷梅，等. 污水中腸道桿菌噬菌體的分離及其生物學活性研究[J]. 南方醫科大學學報，2007，27（10）：1545-1546.

[19]郭秋菊，滕井華，許榮均，等. 大腸桿菌噬菌體的分離、純化及其特性研究[J]. 廈門大學學報：自然科學版，2008，47（增刊2）：273-277.

[20]錢存柔，黃儀秀，林稚蘭，等. 微生物學實驗教程[M]. 北京：北京大學出版社，1999：31-35.

[21]陳 萍，沈明浩，王 平. 出血性大腸桿菌噬菌體933W的分離鑒定和保存[J]. 中國獸藥雜志，2007，41（6）：19-21.

[22]Bourdin G，Schmitt B，Marvin Guy L，et al. Amplification and purification of T4-like Escherichia coli phages for phage therapy：from laboratory to pilot scale[J]. Applied and Environmental Microbiology，2014，80（4）：1469-1476.

[23]趙貴明，仉慶文，姚李四，等. 阪崎腸桿菌噬菌體的分離及其生物學特性[J]. 微生物學報，2008，48（10）：1373-1377.

[24]劉霄飛，任慧英，劉文華，等. 大腸桿菌噬菌體Bp7裂解性能分析[J]. 中國農學通報，2010，26（9）：18-21.

[25]何覓之. 大腸桿菌K88、K99廣譜噬菌體的分離與生物學特性鑒定[D]. 武漢：華中農業大學，2012：25-26.

[26]代保英. 大腸桿菌K88噬菌體的分離、分類初步鑒定和生物學特性的測定[D]. 揚州：揚州大學，2009：44-45.

[27]徐 焰，彭道榮，熊鴻燕，等. 一株寬宿主譜大腸埃希菌噬菌體的RNA比較分析及其環境微生物殺滅效應觀察[J]. 中華流行病學雜志，2005，26（5）：356-360.

[28][JP3]徐 焰，熊鴻燕，宋建勇，等. 1株寬宿主譜大腸桿菌噬菌體的生物[JP2]學特性觀察[J]. 第三軍醫大學學報，2003，25（23）：2106-2108.

[29]秦天呈，姚 彬，王 文，等. 噬菌體治療細菌感染的研究進展[J]. 四川生理科學雜志，2012，34（2）：85-87.

[30]Carlton R M. Phage therapy：past history and future prospects[J]. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis，1999，47（5）：267-274.

[31]Chibani-Chennoufi S，Sidoti J，Bruttin A，et al. In vitro and in vivo bacteriolytic activities of Escherichia coli phages：implications for phage therapy[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2004，48（7）：2558-2569.

[FL）]

[KH*4D]

[HT8.]

[32] Miedzybrodzki R，Fortuna W，Weber-Dabrowska B，et al. Phage therapy of staphylococcal infections （including MRSA） may be less expensive than antibiotic treatment[J]. Postepy Hig Med Dosw，2007，61：461-465.

[33]Tanji Y，Shimada T，Fukudomi H，et al. Therapeutic use of phage cocktail for controlling Escherichia coli O157：H7 in gastrointestinal tract of mice[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering，2005，100（3）：280-287.

[34][JP3]Smith H W，Huggins M B. Successful treatment of experimental Escherichia coli infections in mice using phage：its general superiority over antibiotics[J]. Journal of General Microbiology，1982，128（2）：307-318.

[35]Smith H W，Huggins M B，Shaw K M. The control of experimental Escherichia coli diarrhoea in calves by means of bacteriophages[J]. Journal of General Microbiology，1987，133（5）：1111-1126.