Box—Behnken響應面法優化亞貢多糖的脫蛋白工藝研究

王曉玲+高翔+王秋月+張玲艷

【摘 要】 目的：篩選亞貢多糖的脫蛋白工藝。方法：采用酶法脫蛋白，應用Box-Behnken 響應面法優化最佳工藝，以多糖質量分數和蛋白脫除率為評價指標，考察溫度、反應時間及酶濃度對指標的影響。結果：最優工藝條件為：反應溫度為56-2℃，反應時間為1-27 h，酶終濃度3-7%；多糖質量分數達67-5%，蛋白脫除率為80-4%。結論：該工藝簡單可行，可用于亞貢多糖的純化。

【關鍵詞】 亞貢；多糖；脫蛋白；Box-Behnken 響應面法

【中圖分類號】R914-1 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2015）18-0012-02

Study on Deproteinization from Polysaccharides of Smallanthus sonchilius

WANG Xiaoling GAO Xiang WANG Qiuyue ZHANG Lingyan

The Second Hospital of Tianjin Medicine University， Tianjin 300211， China

Abstract：Objective To optimum conditions for deproteinization form polysaccharides of Smallanthus sonchilius. Methods Box-Behnken Design-Response surface methodology was used to optimize the process of deproteinization and the method was evaluated by the ratio of protein removing and the mass fraction of polysaccharide. Results The better conditions for the deproteinization of crude polysaccharide from Smallanthus sonchilius were that the temperature was 56-2℃， the final concentration of enzyme was 3-7%（m/v） and the reaction time was 1-27 h. Under these conditions， the content of crude polysaccharide was 67-5% and percentages of protein removing of crude polysaccharide was 80-4%. Conclusion The method of enzyme effective method for removal of protein.

Keywords：Smallanthus sonchilius； Polysaccharides； removal of protein； Box-Behnken Design-Response surface methodology

亞貢（yacon）為菊科多年生草本植物亞貢Smallanthus sonchifolius H-Robinson的塊根，又稱雪蓮果、雪蓮薯、菊薯、亞龍果等。常用于加工為飲料、茶及蔬菜等各種產品，也可作為水果直接食用。研究表明，亞貢除作為營養保健品外，還具有一定的藥用價值，具有降血糖、抗動脈粥樣硬化、調節免疫、抗氧化、改善胰島素抵抗等藥理活性[1-5]。目前，亞貢的研究主要集中在根莖中的低聚果糖及葉片中多糖的提取分離及應用，尚未見亞貢根莖中多糖的研究。而植物多糖具有免疫調節、降血糖、降血脂等作用，對亞貢多糖的研究具有一定意義。多糖在提取和純化的過程中常伴有大量植物蛋白，脫蛋白成為提高多糖純度的必備工藝。常用的脫蛋白方法包括：Sevage法（正丁醇與氯仿混合）、三氯乙酸法（TCA法）、酶法。Sevage法和TC法是應用化學試劑使蛋白變性，反應較為強烈，對多糖造成一定的損耗[6]，而酶法條件較為溫和，簡單易行，專屬性強。研究選用酶法，以多糖質量分數和蛋白脫除率為考察指標，采用響應面法對酶法提取的反應溫度、時間和酶的濃度進行優化，為亞貢多糖的合理開發提供實驗依據。

1 儀器與材料

1-1 儀器 TU-1810紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；旋轉蒸發儀（天津科諾儀器設備有限公司）；電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）。

1-2 材料 牛血清白蛋白（美國 Amresco 公司）；考馬斯亮藍G-250（北京鼎國昌盛公司）；木瓜蛋白酶（8×105 U/g，上海士鋒生物科技有限公司）；所用試劑均為分析純。

亞貢購于天津市南開區農貿市場，經天津中醫藥大學張堅老師鑒定為亞貢Smallanthus sonchifolius H-Robinson的塊根。

2 方法與結果

2-1 亞貢多糖的提取 將亞貢洗凈、切片，于60 ℃烘箱中烘干，粉碎，過60目篩，取亞貢干粉末500 g，加20倍量80%乙醇浸提2 h，溫度為90℃，過濾，提取液減壓濃縮至一定體積，加入適量95%乙醇，4℃冰箱過夜，8000 r/min 離心10 min，棄上清得沉淀[7]。冷凍干燥后得粗多糖，測定粗多糖的質量分數為45-4%。

2-2 葡萄儲備液的配置 稱量葡萄糖標準品2-86 mg至10 ml容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，放置4℃冰箱，為儲備液備用。

2-3 線性關系考察 分別吸取葡萄糖儲備液0、2、4、6、8、10 ml置于50 ml棕色容量瓶中，加水稀釋至刻度。依次吸取不同濃度的葡糖糖稀釋液1-0 ml，置干燥試管中，分別加5%苯酚1-0 ml，混勻，在沿試管壁緩緩加入濃硫酸5-0 ml，搖勻，室溫放置30 min后，以取蒸餾水1-0 ml作為空白對照，檢測波長為490 nm，以葡萄糖質量濃度（C）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，得回歸方程為：C=109-1A + 2-997，相關系數r=0-9986。

2-4 蛋白質儲備液的配置 稱取牛血清白蛋白標準品7-41 mg，移至50 ml棕色容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，混勻，備用。

2-5 蛋白質線性關系考察 分別吸取不同濃度蛋白質儲備液0、0-2、0-4、0-6、0-8、1-0 ml置于10 ml的容量瓶中，依次向各試管中加入1 ml的各組稀釋液和3 ml考馬斯亮藍G-250溶液，搖勻，以蒸餾水稀釋，定容至刻度；空白組加入1 ml的蒸餾水，室溫放置30 min，檢測波長為595 nm。以牛血清白蛋白質量濃度（C）為橫坐標，蛋白質吸光度（A）為縱坐標，對所得數據進行線性回歸，得方程為：C=181-3A+ 2-971，相關系數r=0-9982。

2-6 多糖測定 吸取樣品溶液1-0 ml，按“2-3”項測定方法操作，得到吸光度值，根據葡萄糖標準曲線方程，計算樣品中多糖含量。

2-7 蛋白質的測定 吸取樣品溶液1-0 ml，按“2-5”項定方法操作，得到蛋白質吸光度值，根據蛋白質標準曲線方程，計算樣品中蛋白質含量。

2-8 脫蛋白工藝優化 精確配置0-8 g/ml的多糖溶液，選擇反應溫度、反應時間和木瓜蛋白酶濃度3作為考察因素，根據Box-Behnken試驗設計條件，設計3因素3水平分析方法，實驗設計和實驗結果分別見表1、2。

表1 因素水平表

表2 Box-Behnken試驗設計及結果

將結果輸入Design-Expert 8-0軟件進行分析和二項式擬合，以OD值為Y值，提取溫度、反應時間和酶終濃度為自變量，模型方程為：Y=73-89+5-27X1+6-90X2+17-21X3+5-71X1X2+2-73X1X3+1-53X2X3-15-14X12-12-41X22-11-52X32。R2=0-9925，擬合優度較佳，可進行預測分析。

經過二項式方程模擬和工藝預測分析得出，多糖質量分數可達到68-4%，蛋白脫除率最大值為78-3%，最優工藝條件溫度56-2℃，反應時間1-27 h，酶終濃度3-7%。3個因變量對多糖質量分數和蛋白脫除率總評歸一值的影響效果圖見圖1。

2-9 驗證試驗 將“2-8”的最優工藝條件進行3次重復試驗，測得實際多糖質量分數為67-5%，偏差為1-3%；蛋白脫除率為80-4%，偏差為-2-7%。

3 討論

多糖存在于細胞膜結構中，是生命體的基本組成部分，參與多種生命功能活動。多糖具有抗腫瘤、調節免疫、抗氧化、延緩衰老、抗輻射、降血糖、降血脂等廣泛藥理活性。亞貢除作為營養保健品外，還具有一定的藥用價值，有較為廣泛的開發利用前景，且不同來源的多糖對機體的免疫功能具有不同程度的調節作用。亞貢多糖具有一定抗氧化活性[7]，而其他藥理活性有待發現。TCA法除蛋白的原理是沉淀蛋白質，對蛋白的清除率比較大，但會導致多糖的大量降解[8]。酶法原理是水解蛋白質，反應條件溫和，避免了多糖的大量降解，無污染，使蛋白質脫除率達到理想狀態，而使多糖的損失率降至最低。實驗通過Box-Behnken 響應面法對酶法水解蛋白條件進行優化分析，確定了

最佳水解蛋白的工藝條件，產品也由黑色粉末轉變為灰白色粉末，多糖質量分數由42-1%提高到67-5%，提高了亞貢多糖的純度，為亞貢多糖的綜合利用提供新的途徑。參考文獻

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（收稿日期：2015-06-15）