括蒼山葉棲酵母菌資源的研究

金亞倩　胡瓊會　王雪奇

【摘要】在本次實驗研究中，在括蒼山上符合要求的不同區域進行樹葉采集，之后分離出酵母菌，純化后再用簡單法提取酵母菌DNA，PCR擴增26S rDNA D1/D2區，PCR產物經過瓊脂糖凝膠電泳檢測后進行測序，實驗結果初步闡明了括蒼山野生環境中葉棲酵母菌資源的種類概況。

【關鍵詞】酵母菌；括蒼山；26S rDNA D1/D2；分布

引言：

酵母菌是一種單細胞微生物，屬于真菌類，結構簡單，可以通過出芽方式發生無性繁殖，也可以形成子囊孢子進行有性繁殖。目前已經發現的超過1000多種。酵母菌喜愛潮濕、含有糖分的各種物體表面生活，例如土壤、果皮表層、植物表面，甚至空氣當中也存在。酵母菌具有很多特性，在食品生產中、環境保護、工業及科學研究方面等都普遍應用。

一、本實驗采樣地點

本實驗的采樣地點是在浙江省臨海市括蒼山，位于浙江中部沿海，屬亞熱帶季風氣候，溫暖濕潤、四季分明?？紤]到本次實驗以發掘尋找新的酵母菌種為目的，故采樣地點選擇人煙稀少的區域，減少人類活動對酵母菌分布帶來的影響，同時盡可能增大橫向空間距離，提高新酵母菌發現的可能性。

二、采樣方法

本次實驗采樣采用無菌塑料袋進行無菌采樣，樣品主要為生長成熟的老樹葉，葉子在樹上生長時間越久越好，剛剛從樹上飄落下來的為最佳。對葉子的種類沒有特殊要求，可以在不同地理位置選擇同一種類的植物，同一株植物從不同高度采集數片葉子，再隔一段距離進行下一次采集，要保持一定的橫向距離。采集樣品時，一手持著無菌塑料袋，另一只手用剪刀將樹葉剪下來放入袋中，裝好后立馬扎緊袋口，盡量保證取樣過程滿足無菌要求。對采集的樣品逐一編號并寫上植物的名稱。

三、酵母菌的分離和保存

（一）培養基

菌種的分離和斜面均采用PDA固體培養基培養。使用前加入30μg/ml的青霉素，減少霉菌等的干擾。

PDA培養基又叫馬鈴薯培養基，配方如下：馬鈴薯 200g，葡萄糖或蔗糖 20g，瓊脂 15-20g，水1000ml，pH值無需調節。配制過程如下：

①稱量和熬煮。計算出藥品的實際用量，馬鈴薯去掉表皮稱取200g，用小刀切成適當的塊狀放入鍋中，加水1000ml。在加熱爐上加熱至沸騰，期間稍加晃動幾次鍋防止粘鍋，沸騰后持續加熱30min。用雙層的紗布在量杯上過濾，剩下的濾渣倒掉，濾液用水補充到1000ml。

②濾液倒入鍋中，加入蔗糖20g，瓊脂20g，攪拌均勻。

③將配制的培養基分裝到500ml的三角瓶或試管中。

④加塞，包扎。為防止外界環境中的微生物進入試管或三角瓶污染培養基。分裝完成后，每個試管口和三角瓶口塞上棉塞，用舊報紙包好并用橡皮筋捆緊，防止滅菌時冷凝水濕潤棉塞而影響實驗結果。

⑤滅菌。將加塞包扎過的培養基放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在121℃條件下滅菌30min。滅菌完成后取出培養基冷卻一段時間。

⑥倒平板。滅菌后的試管擺斜面，斜面的長度不能超過試管長度的1/2。滅菌的三角瓶冷卻到一定溫度，加入一定量的青霉素，提高培養基的抗菌能力，特別是抗細菌能力，有利于真菌分離。然后在無菌操作臺上倒平板，每個平板倒約20ml的培養基。

（二）酵母菌分離

①準備與樣品數量相同的培養皿，分組，用舊報紙包好并用橡皮筋扎緊。將包裝好的培養皿用高壓蒸汽滅菌鍋在121℃條件下滅菌30分鐘。

②滅菌完成后將培養皿放入干燥機干燥待用。（干燥機需在有人看管情況下使用防止發生安全事故）

③雙手洗凈，用酒精棉消毒。在無菌操作臺上，將采摘的葉子逐一取出來取適量大小用凡士林粘在培養皿蓋上并一一記號。完成后的樹葉培養皿放置在實驗臺上靜置一天。

④，將昨天的樹葉培養皿蓋在無菌操作臺上換至有有培養基的培養皿上。放入培養箱一天。

⑤無菌條件下，將第二次粘有樹葉的培養皿蓋換至新的培養基上。第一次的培養基一一標上編號，倒置培養，樹葉培養基正放培養。

（三）酵母菌純化

①取出所有的酵母菌培養皿，去掉無酵母菌的培養基。

②涂布。在無菌條件下，取培養基上的酵母菌在新的培養皿上涂線，一個培養皿涂兩種菌，盡可能地取多種菌，各自在培養皿底編號，放入培養箱倒置培養。培養兩天。

四、酵母菌DNA提取

采用簡單法提取酵母菌（用于D1/D2和ITS區序列分析），具體方法參照Makimura et al進行。

①取1.5mL離心管，加入100μL裂解液，用無菌接種環取少量新活化菌體（1環）混勻。

②100℃條件下水浴15min，冷卻后加入100μL的2.5M醋酸鉀，用手甩幾次搖晃均勻，放置于冰上0.5h（此時離心機開始預冷）。

③在4℃、13000rpm條件下離心10min，上清液（大約170μL）移至新的滅菌1.5mL離心管內。

④加等體積（大約170μL）的氯仿-異丙醇（24：1），顛倒離心管劇烈震蕩約10min，然后在13000rpm離心15min，移取上清液（約100μL）至另一1.5mL離心管。

⑤加入等體積預冷異丙醇，手甩幾次混勻后在-20℃下靜置15min；4℃、13000rpm條件下離心10min，倒掉上清液，同時打開35攝氏度烘干箱備用。

⑥用100μL的70%乙醇洗滌沉淀，輕甩后放置10min，4℃、13000rpm條件下離心10min。

⑦棄掉上清液，離心管倒扣在紙上數次，并用小塊紙吸去殘水，開蓋向上過夜自然干燥。

⑧加入50μL已滅菌的雙蒸水，室溫下溶解30min，放于-20℃冷藏備用。

五、瓊脂糖凝膠電泳

對PCR擴增的原液樣品進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。瓊脂糖凝膠電泳是核酸分析常用的技術，在此次實驗中對酵母菌核酸分析中也是重要的步驟，主要步驟如下：

1%瓊脂糖凝膠配制：1g瓊脂糖+100ml1×TAE， 使用微波爐加熱使瓊脂糖均勻溶解。待凝膠溫度降至50℃后加入EB液。等到溫度不燙手后將凝膠溶液緩慢倒在電泳凝膠板上，去掉里面的氣泡。等到凝膠固定后將點樣梳取出來。電泳槽內加入電泳緩沖液，膠板放到電泳槽中，有點樣孔的這一頭要靠近電泳槽的負極，緩沖液要蓋過膠面。連接電源，開始電泳，75V電泳10至15min。

六、結論

此次從臨海市括蒼山上采集的樹葉中分離得到38種菌株，經過26S rDNA D1/D2區序列分析，根據搜索得到的結果，可以確定011菌株為Derxomyces mrakii、014菌株為Tremellales sp.、022菌株為Sporobolomyces sp.、023菌株為Sporobolomyces ogasawarensis、031菌株為Sporobolomyces oryzicola、032菌株為Sporobolomyces carnicolor、037菌株為Bullera pseudovariabilis。因此可以得知，括蒼山區域內至少存在以上七種酵母菌。在研究過程中也發現了疑似新的酵母菌物種。臨海市括蒼山植物上的葉棲酵母菌資源，值得進一步研究。

參考文獻

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作者簡介：金亞倩（1992年-），浙江臺州人，臺州市綠科檢測技術有限公司，綜合部，負責商務。