藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測技術指南（試行）概要

中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會

前言

藥物體內代謝、轉運及藥物作用靶點基因的遺傳變異及其表達水平的變化可影響藥物的體內濃度和敏感性，導致藥物反應性個體差異。近年來，隨著人類基因組學的發展，藥物基因組學領域得到了迅猛發展，越來越多的藥物基因組生物標記物及其檢測方法相繼涌現。藥物基因組學已成為指導臨床個體化用藥、評估嚴重藥物不良反應發生風險、指導新藥研發和評價新藥的重要工具，部分上市的新藥僅限于特定基因型的適應癥患者。美國食品和藥品管理局（FDA）已批準在140余種藥物的藥品標簽中增加藥物基因組信息，涉及42個藥物基因組生物標記物。此外，部分行業指南也將部分非FDA批準的生物標記物及其特性（如MGMT基因甲基化）的檢測列入疾病的治療指南。藥物反應相關基因及其表達產物的分子檢測是實施個體化藥物治療的前提。

藥理學與遺傳學結合的關鍵環節包括藥物代謝動力學（PK）和藥物效應動力學（PD）兩方面。藥物代謝動力學主要是定量研究藥物在生物體內吸收、分布、代謝和排泄規律，側重于闡明藥物的體內過程；藥物效應動力學主要研究藥物對機體的作用、作用規律及作用機制，其內容包括藥物與作用靶位之間相互作用所引起的生化、生理學和形態學變化，側重于解釋藥物如何與作用靶點發生作用。對藥物代謝酶和藥物靶點基因進行檢測可指導臨床針對特定的患者選擇合適的藥物和給藥劑量，實現個體化用藥，從而提高藥物治療的有效性和安全性，防止嚴重藥物不良反應的發生。

本指南旨在為個體化用藥基因檢測提供一致性的方法，所指的藥物基因組生物標志物不包括影響抗感染藥物反應性的微生物基因組變異。此外，腫瘤靶向治療藥物個體化醫學檢測指南見《腫瘤個體化治療的檢測技術指南》。

本指南起草單位：中南大學湘雅醫院臨床藥理研究所、中南大學臨床藥理研究所、中南大學湘雅醫學檢驗所，并經國家衛生計生委個體化醫學檢測技術專家委員會、中國藥理學會藥物基因組學專業委員會、中國藥理學會臨床藥理學專業委員會和中華醫學會檢驗分會組織修訂。

本指南起草人：周宏灝、陳小平、張偉、劉昭前、尹繼業、李智、李曦、唐潔、俞競、彭靜波、曹杉、成瑜。

1 本指南適用范圍

本指南由國家衛生計生委個體化醫學檢測技術專家委員會制定，旨在為臨床檢驗實驗室進行藥物代謝酶和藥物靶點基因的檢測提供指導。本指南的主要適用對象為開展個體化醫學分子檢測的醫療機構臨床實驗室。

2 藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測概述

藥物代謝酶和藥物作用靶點基因特性的變化可影響藥物的體內濃度和靶組織對藥物的敏感性，導致藥物反應性（包括藥物的療效和不良反應發生）個體差異。藥物基因組生物標志物的檢測是臨床實施個體化藥物治療的前提。從藥物代謝酶和藥物作用靶點基因出發，對個體化用藥基因檢測的適應人群、標本采集、運輸、接收、處理、樣本檢測、結果報告與解釋、室內室間質控需遵循的基本原則，以及可能出現的問題與應對措施等方面的內容進行介紹，可為基于藥物代謝酶和藥物作用靶點的基因檢測提供標準化指導。

3 藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測分析前質量保證

根據臨床檢驗實驗室的條件確定合適的分子診斷項目和恰當的樣本處理是確保核酸定性定量檢測準確性的關鍵。檢測前必須確保標本的采集、運輸和儲存符合要求。標本處置不當可能引起核酸降解，導致定量檢測結果不準確。

3.1 采樣前準備

3.1.1 分子診斷項目的申請與完善：藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測在采樣前需填寫規范的申請單，申請單應包含足夠的信息，以識別患者和有資格開具申請單的臨床醫生。臨床醫生應根據臨床需求合理選擇分子診斷項目。個體化用藥領域發展迅速，臨檢實驗室應加強與臨床醫師的溝通，及時指導臨床醫師選擇有價值的診斷項目，幫助醫師合理解釋檢驗結果；不斷接受正確合理的臨床醫師的反饋意見，及時了解臨床對個體化用藥分子檢測的需求，優化項目目錄。實驗室應根據其具體的工作流程確定質量監測指標，如患者診斷信息完整率、適當臨床判斷率等，并定期對數據進行回顧性分析，定期對檢驗申請進行評審。

3.1.2 患者的正確識別及知情同意：患者的正確識別是確保獲得正確臨床標本的前提。收集標本的容器上應注明患者的信息，通常應包括姓名、送檢醫院及科室、住院號等。醫護人員在采樣前需首先核對確定患者的身份，核實標示患者的信息。

標本收集前應向患者介紹個體化用藥基因檢測的意義，以得到患者的認同，即知情同意。采樣前需告知患者所檢測項目的目的、意義、基本過程、項目可能存在的不足（如檢測結果可能出現與臨床用藥實際不相符的情況）、剩余核酸的去向（包括可能匿名用于科研項目）及保存時間，保護受檢者的個人隱私（包括醫療記錄和醫療數據）。對實施有創檢查的分子診斷項目如穿刺取活檢組織，應清楚地告知患者及家屬檢查可能遇到的風險和緊急情況下的預案。知情同意書是醫方履行如實告知義務的證據，也是患者行使選擇權的書面依據。

3.1.3 送檢單的填寫與項目的復核：標本采集前需填寫送檢申請單，提供受檢者必需的信息。申請單需填寫的信息包括：申請的檢測項目、標本編號、受檢者姓名、性別、出生日期、民族、采樣日期及時間、標本來源（組織類型）、相關臨床資料（如身高、體重、疾病診斷、疾病分型分期、合并疾病、用藥情況）、采樣單位及科室名稱、送檢醫師姓名等信息。臨檢實驗室應有專業人員根據信息采集表對檢測項目的合理性進行審核，必要時可與送檢醫師討論。

3.2 標本采集：臨床分子診斷實驗室應對各種個體化用藥分子診斷臨床標本的采集按檢測要求建立標準操作程序（SOP）。標本采集人員應經過系統的培訓。采樣前應對標本采集容器進行評價，確保容器本身不會干擾測定過程，并保存評估記錄。用于藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測的標本在采集時間上無特殊要求。靜脈血液采集之前應按要求對預采血的部位徹底消毒。腫瘤組織中DNA的分析利用常規診斷所用的標本即可，但用于RNA分析的標本需專門采集，并準備好液氮等速凍所需的材料及設備。標本采集需要在密閉、一次性采樣系統中完成，所用的材料如注射器、棉簽、拭子等應為一次性使用，以防止污染。無論采集哪種類型的標本，采樣時都必須戴手套，以避免標本中病原微生物感染和皮膚脫落細胞對標本的污染。

用于藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測的標本類型有多種，包括全血標本、 組織標本（新鮮組織、冰凍組織、石蠟包埋組織、穿刺標本）、口腔拭子、骨髓、胸腹腔積液等。樣本采樣原則見《個體化醫學檢測質量保證指南》。

3.2.1 全血和骨髓標本：全血標本采集到含有適當抗凝劑或添加物的采樣管中，添加物根據被測量種類（細胞內DNA、 RNA）、檢測項目和采樣體積而定。因肝素可抑制PCR反應中酶的活性，全血或骨髓標本一般用EDTA或枸櫞酸鹽抗凝。采樣前需在采樣管或注射器上標注標本信息。全血標本采集外周靜脈血2～3 ml并置于采血管中，將采血管輕輕顛倒混勻數次以確保充分抗凝，避免溶血。如檢測目的是細胞內RNA，建議用含RNA穩定劑的采樣管，或采樣后盡快將全血或骨髓加入到RNA穩定溶液中。采集干血斑標本時，可向無菌濾紙上滴加約50 μl全血，根據需要可連續在數個印圈上滴加標本，于室溫自然干燥至少4小時。干血斑標本采集時不要堆疊血斑，不與其他界面接觸，待血斑充分干燥后應放入無菌袋中，避免血斑之間的相互污染，同時加入干燥劑和濕度指示卡，密封包裝后運送。

3.2.2 組織標本：當待檢測的組織與血液或口腔脫落細胞基因型不一致時，或當組織是待測核酸必須的來源時（如檢測腫瘤組織中mRNA表達、融合基因、基因擴增或缺失、甲基化水平、微衛星不穩定等），需采集組織標本進行檢測?？捎玫慕M織標本包括新鮮組織、活檢組織、石蠟包埋組織和石蠟切片。

① 新鮮組織和活檢組織：采樣大小取決于組織類型。一般而言，無論是哪種組織類型，在沒有大量脂肪細胞侵潤的情況下，10 mg組織標本可提取DNA或RNA 10 μg。無菌條件下，取米粒大小手術或活檢組織（約25 mg）；腫瘤組織要求未壞死腫瘤組織比例＞70%。穿刺取實體腫瘤組織時，取得的細胞數與穿刺針的粗細有關，21G細針每次獲得≥100個細胞，19G細針每次獲得≥150個細胞，支氣管活檢每次獲得≥300個細胞，CT介導的細針穿刺每次可獲得≥500個細胞。通常檢測時標本中腫瘤細胞的數量需達到200～400個。在某些情況下，要求同時采集無病變的組織或外周血作為對照（如微衛星不穩定性檢測）。組織塊取樣后的處理與保存見《個體化醫學檢測質量保證指南》。

② 石蠟包埋組織：推薦用10%中性緩沖甲醛溶液固定組織標本，避免使用含重金屬離子的固定液（如Bouin液）等。甲醛介導的DNA損傷在固定3小時后明顯發生，且時間越長，DNA損傷越嚴重。因此，推薦較小的組織（如活檢組織標本）固定6～12小時，較大的組織（如手術切除標本）固定6～48小時。甲醛固定的石蠟包埋組織不適于用作RNA檢測，但在沒有其他標本可供選擇時，可考慮選擇沒有污染部分提取的RNA用于檢測，待測RNA序列的長度最好＜130 bp。組織標本切片時應特別注意避免標本間的交叉污染。

③ 組織切片：用于DNA檢測時，手術標本需提供10 μm厚的石蠟切片4～8張，面積為成人拇指蓋大??；活檢穿刺標本需提供10 μm厚切片8～10張。所有切片均為白片。腫瘤組織切片應在HE染色后，經病理醫師顯微鏡下觀察，以判斷是否含有腫瘤細胞及腫瘤細胞的數量是否足夠（一般要求＞50%）、壞死組織比例＜10%，并在對應的白片上畫出癌巢，對腫瘤細胞密集區域進行標注。DNA測序法要求腫瘤細胞至少占組織細胞的50%。應采取措施避免核酸交叉污染，制備不同患者病理切片標本時，需更換新刀片。

3.2.3 口腔脫落細胞：口腔脫落細胞可同時用于DNA和RNA分析。常用的是口腔拭子，患者清水漱口后，將消毒醫用棉簽伸進口腔，在口腔內側臉頰粘膜處左右反復擦拭20次左右，取出棉簽，將棉簽置于干凈濾紙上陰干，每位受檢者至少采集棉簽3根。棉簽立即放入干凈封口塑料袋內封閉并放入紙質信封，信封上應做好詳細標記。濾紙應經過滅菌處理，以防細菌生長抑制核酸酶的活性。漱口標本也可作為口腔脫落細胞的來源。用于RNA分析的口腔脫落細胞必須保存在RNA穩定劑中。

4 藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測分析中質量保證

藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測必須有嚴格的質量控制措施，涉及基因擴增的檢測項目必須在通過技術審核的臨床基因擴增檢驗實驗室完成。分析中質量控制的內容包括：實驗室設計的要求；檢測程序的選擇、驗證及確認；儀器設備的使用、維護與校準；人員培訓；樣本的準備（如核酸純化等）；執行檢測；確認檢測結果的可靠性。實驗室應制定室內SOP和參加室間質評或實驗室間比對。

4.1 實驗室設計要求：原則上按照《個體化醫學檢測質量保證指南》的要求進行。作為藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測核心技術之一的PCR，要保證結果的可靠性和準確性，首要措施就是防“污染”。檢測實驗室應按《醫療機構臨床基因擴增實驗室管理辦法》要求進行設置，并按要求嚴格控制空氣流向，避免PCR產物污染。

4.2 檢測方法：藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測過程一般包括核酸提取和靶標檢測兩個階段。

用于靶標檢測的方法包括PCR-直接測序法、PCR-焦磷酸測序法、熒光定量PCR法、PCR-基因芯片法、PCR-電泳分析、PCR-高分辨率熔解曲線法、等位基因特異性PCR法、PCR-限制性片段長度多態性方法、原位雜交（ISH）等多種方法，每種方法的原理和優缺點如表1。

① PCR-直接測序法：也稱PCR-Sanger測序，該方法基于雙脫氧核糖核酸（ddNTP）末端終止法，根據核苷酸在某一固定點開始延伸，隨機在某一特定堿基處終止，由于摻入的每個堿基都進行了熒光標記，因此產生了以A、T、C、G結束的4組相差一個堿基的不同長度系列核酸片段；通過毛細管電泳分離這些片段后讀取待測核酸的堿基序列。Sanger法測序是DNA序列分析的經典方法。由于該方法可直接讀取DNA序列，因此被認為是基因分型的金標準。

② PCR-焦磷酸測序法：本方法是由4種酶催化的同一反應體系中的酶級聯化學發光反應。實驗需設計一條生物素標記的測序引物，當引物與單鏈模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶4種酶的協同作用下，將引物上每一個dNTP的聚合與一次熒光信號的釋放偶聯起來，通過檢測熒光的釋放和強度，達到實時測定DNA序列的目的。所需試劑包括樣本處理試劑、核酸擴增試劑、單鏈模板制備試劑、焦磷酸測序試劑和陽性質控品五大類。所需儀器為PCR儀和焦磷酸測序儀。為避免假陽性和假陰性結果，應嚴格區分陽性質控品和反應試劑的使用，防止因試劑污染致假陽性發生。

③ 實時熒光PCR法：根據檢測原理的不同，實時熒光PCR法可分為探針法和非探針法兩種，前者利用與靶序列特異雜交的探針（Taqman和分子信標）來指示擴增產物的增加，后者利用熒光染料或特殊設計的引物來指示擴增產物的增加。Taqman探針法同時綜合了5’端核酸酶活性和熒光等技術，其在反應過程中使用4條寡核苷酸鏈，其中兩條為等位基因特異性探針，兩條為PCR引物。兩條探針可分別與突變型和野生型模板互補，其兩端分別應用含報告基團和淬滅基團的染料進行標記，兩條探針的報告基團熒光染料不一樣。在進行單核苷酸多態性（SNP）檢測時，PCR擴增的退火過程導致探針與模板雜交結合，當引物延伸至探針處時，DNA聚合酶5’端外切酶活性將探針的5’端報告基團從探針上切除，使之與淬滅基團分離，從而釋放出相對應的熒光，而沒有配對的探針仍然保持完整而不會發出熒光。不同的等位基因探針由于標記的熒光染料不同，因此所發熒光信號不同，可通過對熒光信號的檢測判斷樣本的基因型。

表1 各種藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測技術優缺點及適用性比較

④ PCR-基因芯片法：該方法以特定的寡核苷酸片段作為探針，將其有規律地排列固定于支持物上，然后將樣品DNA通過PCR擴增、熒光標記等程序，按堿基配對原理與芯片雜交，再通過熒光檢測系統對芯片上的熒光信號進行檢測和分析，從而迅速獲得個體的基因型信息?；蛐酒中头ǖ牟僮鬟^程包括PCR核酸擴增、雜交、芯片掃描和結果分析。

⑤ PCR-電泳分析：該方法是指對待分析的目的基因片段進行PCR擴增，并通過瓊脂糖凝膠電泳或毛細管電泳分析，根據PCR產物大小對基因多態性位點進行基因分型。該方法屬于定性檢測，且只能用于對已知的多態性位點進行檢測，不能識別未知多態性位點。瓊脂糖凝膠電泳法適用于對片段較長的插入缺失多態性進行檢測，如血管緊張素轉化酶（ACE）插入缺失多態性；毛細管電泳法適于對較短的插入缺失多態性如UGT1A1*28多態性和微衛星不穩定性（MSI）進行檢測。PCR過程中需建立陽性質控品和陰性質控品，電泳分析時需同時用分子量標記物進行片段大小的判斷。當分子量標記物反應管無條帶或出現較弱的條帶時，可能的原因包括點樣孔漏、熒光染料不夠或失效、電泳時間過長或電壓過大。該方法的優點是成本低，在普通實驗室即可開展；缺點是只適合對DNA插入/缺失多態性或融合基因進行定性測定，不能用于SNP的檢測。

⑥ PCR-高分辨率熔解曲線（HRM）法：該方法通過對PCR反應的熔解曲線分析進行基因分型。PCR擴增的熔解曲線取決于其擴增序列，序列中一個堿基的差異都可導致雙鏈DNA的解鏈溫度發生變化。HRM法應用實時熒光定量PCR儀監測這種細微的溫度變化，確定所擴增的目的片段中是否存在突變，從而用于基因分型。HRM法分析使用LC Green等飽和熒光染料，該類染料在飽和濃度時對PCR反應無抑制作用，因此可以高濃度使用，從而全部結合DNA雙螺旋結構中的小溝。在雙鏈DNA的變性過程中不存在熒光分子的重排，其特異度得到大幅提升，因此，熔解曲線細微的變化可以反映擴增片段中堿基的差異。應用本方法進行基因分型屬于定性分析。

⑦ 等位基因特異性PCR（AS-PCR）：又稱為擴增阻滯突變系統PCR（ARMS-PCR）。該技術的基本原理：由于Taq DNA聚合酶缺乏3’到5’端的外切酶活性，3’端錯配的堿基會導致引物延伸速度變慢，當錯配達到一定程度時，引物延伸將終止，得不到特異長度的PCR擴增產物，從而提示模板DNA沒有與引物3’端配對的堿基，反之則有。因此，AS-PCR反應需要兩條等位基因特異的引物和一條共用的反向引物，兩條非特異性引物在3’端與模板錯配，但其他部分堿基序列完全一樣。只有引物的3’端與模板完全配對時，PCR擴增才可以進行。PCR產物可通過凝膠電泳進行分析和基因型的判斷。該方法也可與實時熒光定量PCR結合起來進行基因分型。該方法可以用于檢測各種類型的SNP，其優勢是靈敏度高，特別適合于對腫瘤組織中的體細胞突變進行檢測，缺點是假陽性率較高。

⑧ PCR-限制性片段長度多態性方法：限制性片段長度多態性方法（RFLP）是一種基于酶切原理的方法，是最早用于基因分型的經典方法之一，現在仍被廣泛采用。該方法主要基于某些限制性內切酶可以特異性識別某一特定序列和結構DNA，并對其進行剪切的原理。限制性內切酶通常識別雙鏈DNA的某一特定序列，并在特定位置或者附近將雙鏈DNA切斷，從而產生較短的DNA片段。由于限制性內切酶識別序列的嚴格性，一個堿基的變化都可以導致酶切活性的消失。利用這一特性，若待分型的SNP位點在某一限制性內切酶的識別位點上，將會導致該酶只對其中的一種等位基因具有酶切活性。因此，對位于限制性酶切識別位點的SNP進行分型時，可以使用包含該位點的PCR產物與相應的限制性內切酶進行溫育。將酶切產物進行電泳，并根據酶切產物片段的大小來進行基因分型。該方法不需要任何探針，也不需要特別的儀器設備，成本較低，實驗過程簡單，可操作性強。但缺點也很明顯，主要是通量太低，大量分型時工作量大，并且只適用于部分SNP分型。

⑨ 原位雜交（ISH）法：ISH法以各種人體標本，包括相應實驗方法制備的細胞學和組織學標本（福爾馬林固定石蠟包埋）作為靶標，采用目的DNA探針與該靶標進行分子雜交，從而檢測相關的靶基因異常。ISH技術按照探針標記物的類型，可分為亮視野原位雜交和熒光原位雜交（FISH）。ISH法檢測的靶標具有完整的細胞核，無需進行核酸的提取。其具體的方法學原理見《原位雜交 （ISH）指南》。在藥物代謝酶和靶點基因檢測中，ISH法主要用于測定基因擴增和基因缺失異常。

4.3 藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測項目及類型（表2）：遺傳藥理學知識庫（PharmGKB）根據項目成熟程度將個體化用藥基因檢測項目分為4級，并認為其中1級項目（包括1A級和1B級）滿足臨床應用的最高標準，而4級項目適于臨床應用的證據最少。1A級項目為同時獲臨床遺傳藥理學實施聯盟（CPIC）、認可CPIC藥物基因組學指南的醫學會、以及美國國家衛生研究院藥物基因組學研究網絡（PGRN）認同的項目，這類項目通常經大規模隨機對照臨床試驗（RCT）對項目的意義進行了論證；1B級項目有確切的臨床證據提示相關性，且這種相關性被具有一定樣本規模的研究所證實，但還需進一步的臨床證據。根據檢測項目所涉及的基因在影響藥物反應中的作用機制和靶分子（DNA或RNA）的不同，個體化用藥分子檢測項目包括藥物代謝酶與轉運體基因遺傳多態性檢測、藥物作用靶點基因遺傳變異檢測、其他基因變異檢測和藥物作用靶點基因mRNA表達檢測四種類型。

4.4 儀器設備的使用、維護與保養：原則上按照《個體化醫學檢測質量保證指南》的要求進行。藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測涉及的儀器設備眾多，實驗室可參考生產商提供的操作說明書編寫書面的、有案可查的預防性維護及校準計劃，確定儀器設備的維護周期，建立儀器設備日常維護的SOP。對于某些計量分析儀器，應依照我國計量法規定，由計量檢定機構定期進行校驗，并保存好校驗證書。加熱系統及冰箱等設備的維護包括對溫度進行監測。儀器維護過程中要注意清潔劑的使用，尤其是儀器的光路系統。每臺儀器應該配備專用的清潔工具。在例行儀器的維護和保養后，應填寫儀器維護保養記錄表。如維護中發現問題，應及時匯報并將出現的問題詳細記錄，最后由維護操作人員簽名。

4.5 人員培訓：原則上按照《個體化醫學檢測質量保證指南》的要求進行。藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測通常要涉及試劑配制、核酸提取、儀器編程、結果分析和報告等步驟。操作人員需要有一定的專業技術知識和經驗才能獲得穩定可靠的檢測結果。

加強人員培訓是確保檢測質量的關鍵。人員培訓分為入職培訓、內部培訓和外部培訓。通過培訓，讓操作人員掌握和建立安全操作的概念、“防污染”的概念、具備獨立進行質控活動和儀器維護的能力、可對試劑和質控品的出入庫及使用情況、設備保養等情況進行準確記錄，進行數據分析。實驗室工作人員在培訓后書面確認其已接受適當的培訓，閱讀并理解了相關SOP。實驗室應對其工作人員進行處事能力考核和周期性能力再考核，定期開展內部培訓。外部培訓包括國家衛生計生委臨床檢驗中心和國家衛生計生委個體化醫學檢測培訓基地等機構組織開展的各種技術培訓。

4.6 檢測體系的性能驗證：原則上按照《個體化醫學檢測質量保證指南》的要求進行。臨床檢驗實驗室應用的體外診斷試劑包括國家藥品食品監督管理總局（CFDA）批準的試劑盒和國家衛生計生委個體化醫學檢測試點單位通過性能評定，具有嚴格SOP的自配試劑（LDT）。所有試劑都需進行性能評價。實驗室所購買的商業化儀器應根據說明書進行驗證。在報告結果之前實驗室應該證明其性能能夠滿足廠家規定的準確度、精密度、線性與可報告范圍和參考區間。實驗室還應該為每個檢測系統建立性能規范，包括適用性、準確度、精密度和分析特異性（包括干擾物質）、可報告范圍和其他重要特性，并根據性能規范確定系統的校準和質控程序，保持性能特征建立、校準和質控程序相關活動的記錄。同時也需對檢驗中的耗材進行質檢。

表2 藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測項目及其用藥指導

個體化醫學分子檢測包括定性檢測和定量檢測。定性檢測的性能驗證指標主要包括重復性、精密度、準確度（突變型的檢測能力）、分析特異性、檢出限等，可參考美國臨床實驗室標準化協會（CLSI）的EPl2-A2文件進行檢測。定量檢測監測體系性能驗證的指標主要包括準確度、精密度、線性、可報告范圍、檢出限、參考區間、靈敏度、特異性等。

線性分析可直接分析已知濃度的樣品，也可將一定濃度的樣品進行系列稀釋后，根據稀釋因子來研究檢測值與逐步下降的預期估計濃度之間是否存在線性關系?？蓤蟾娣秶悄軌驁蟾娴目煽康淖畹秃妥罡邫z測結果，實驗室可通過“多點法”進行簡單驗證，推薦應用5個不同濃度水平的樣品進行驗證。

LoD是指可被檢測體系檢出的最低檢測濃度，又稱最小檢測濃度或檢測底限。建立和驗證LoD時，需同時建立、驗證空白檢測限。檢出限一般由廠家、方法建立者完成，實驗室LDT試劑應確立方法的LoD。LDT試劑的性能評估包括樣品的類型與數量、所選擇的參比方法、評價指標、準確度、重復性與精密度、線性范圍、檢測范圍、分析的靈敏度與特異性、參考區間或臨界值（cut-off）及臨床性能評估結果。具體可參考國家衛計委《個體化醫學檢測LDT研制技術規范》。

5 藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測分析后質量保證

原則上按照《個體化醫學檢測質量保證指南》的要求進行。分析后質量保證包括檢測報告、結果解釋、報告發放與咨詢、檢測后樣本的保存和處理。

5.1 檢測報告的內容、解釋及發放

5.1.1 檢測報告的內容及要求：檢測報告應通俗易懂，應在盡可能避免歧義的情況下客觀地解釋結果，以確保臨床醫生能正確解讀。

報告單要求有統一的格式和書寫內容要求，報告應包含的內容：醫療機構或實驗室名稱、項目名稱、標本編號或條碼、送檢單位及（或）科室名稱、患者信息（姓名、性別、年齡）、標本類型、標本采集與接收時間、送檢醫生姓名、疾病診斷、報告單出具的時間、標本處理過程、檢測方法和主要設備、檢測過程、檢測結果并附相關圖表、結果解釋、用藥方案建議、檢測的局限、必要的參考文獻、檢測人員、審核人員和復核人員簽字、結果報告日期和備注、檢測單位聯系信息。

檢測結果應以清晰易讀且易被醫師和患者理解的形式進行報告，報告單上應采用標準化的基因命名和計量單位。定量檢測應注明參考區間、檢測方法的線性或測定范圍；定性檢測可直接寫基因型、基因擴增有無、微衛星不穩定的程度（低、中、高）、甲基化有無等。

5.1.2 檢測結果的解釋：根據藥物基因組生物標志物檢測指導個體化用藥主要包括兩種類型：一是根據個體的遺傳信息調整用藥劑量，以增加藥物療效，減少藥物不良反應的發生；二是根據個體的遺傳信息確定用藥的種類，避免應用針對特定基因型個體無效或可能產生嚴重藥物不良反應的藥物。

藥物劑量的調整往往需根據RCT的結果；對目前缺乏RCT的遺傳變異，可依據基因型對影響藥物的藥代動力學曲線下面積大小估算用藥劑量；當一個藥物的反應性受多個基因或基因與環境因素間相互作用影響時，可根據國內國際大規模臨床試驗推導出的納入了個體基因型及其他因素的用藥劑量計算公式確定用藥劑量。

常見藥物代謝酶和藥物作用靶點基因遺傳變異檢測結果對臨床用藥的指導建議見表2。

5.1.3 檢測結果的報告流程與發放：檢測報告通常以紙質報告單形式或以電子版通過網絡形式發放。藥物代謝酶和靶點基因檢測結果報告需要有嚴謹有效的流程，以確保檢驗信息的完整、有效、及時、正確、隱私。首先要對檢測結果報告進行審核分析，包括審核檢測過程的有效性、受檢者的基本信息、結果數據分析。審核者應當是主管技師以上的工作人員、本專業實驗室負責人、高年資檢驗人員和臨床實驗室主任授權人，審核者對檢驗報告的質量負責。

通過審核的檢測報告可以報告單形式或通過檢測實驗室的信息管理系統發放。應建立檢測報告單發出和管理制度。明確檢測結果報告發放的程序和責任，設定并公示檢測結果報告時間，報告時間是指從接受送檢標本起，到檢測結果發放的時間。應制定個體化用藥基因檢測數據管理制度，數據中應錄入患者信息和檢驗數據；檢測數據的修改必須征得報告結果簽發人員同意后，由操作人員進行修改；所有檢測報告和原始記錄應當歸檔保存，實驗室信息系統數據至少要拷貝3份并保存在不同的地方，以便日后核對。一般檢驗報告單和檢測結果數據至少保存兩年；室內質控和參加室間質量評價的記錄和質控信息至少保存兩年；儀器狀態和維修記錄要保留到儀器使用終身。檢測結果的查詢通?？筛鶕颊咝彰?、標本編號、檢測項目和送檢日期進行查詢。

檢測報告發放后收到檢測報告投訴需記錄并統計，分析原因，避免二次錯誤。

5.1.4 檢測后咨詢服務：個體化醫學分子診斷實驗室應配備相關資質、取得國家衛生計生委個體化醫學檢測培訓基地培訓合格證的個體化用藥咨詢人員，對檢測項目提供咨詢服務，負責對檢測報告在臨床上出現的各種情況進行解釋和檢后服務。

5.2 檢測后樣本的保存和處理：樣本完成檢測后要進行一定時間（盡可能長期）的保留，以備必要時復查。標本的保存也可為科研工作的開展和回顧性調查提供條件。完成檢測后剩余的DNA樣本至少在-80℃保存2年。DNA在-70℃的環境下可保存至少7年。純度不高的DNA樣品建議保存在-20℃或更低的溫度中，以確保DNA的完整性。在不影響受檢者個人隱私及利益的前提條件下，DNA及臨床資料也可匿名用于科學研究，但需在知情同意書中明確。廢棄的樣本應作為生物危險品處置。

6 藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測的質量保證

藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測的質量控制與保證是個體化醫學檢測質量保證的核心內容，是個體化用藥基因診斷規范化和標準化的首要前提。因此，臨床檢驗項目的計劃和準備，試驗性能確認/驗證以及檢驗全過程都需要建立有效的質量控制體系。

6.1 檢測確認和特征描述：在將檢測用于臨床工作之前應該對方法進行分析確認和臨床確認。實驗室應確定待檢測的靶核酸、確定要使用的試驗方法和建立試驗性能確認/驗證的計劃和程序。確認/驗明程序應該包括：檢驗目的；靶基因，基因序列和突變；預期患者人群；被比較的試驗方法，或要使用的方法；使用的樣本類型；要確定的分析性能特征；參考材料的來源；如何分析性能規范；如何規定試驗的局限性；出現問題時的糾正措施。

6.2 可操作性的SOP編寫：有可操作性的SOP是個體化醫學檢測實驗室質量管理的靈魂。SOP源于儀器和試劑說明書、一些標準文件和實驗室實驗工作經驗的積累，應包括試劑準備、標本采集、標本接收與預處理、核酸提取、測定方法、結果分析和報告、儀器操作、實驗室安全措施等臨床檢驗的各個環節。SOP的編寫應注意通俗易懂、注重細節、清晰明了、圖文并茂。實驗室工作人員應嚴格遵循SOP中的步驟要求進行操作，當發現SOP有“故障”時，經過技術研發小組的工作人員討論、實驗驗證后及時修改。

6.3 質控品與室內質控

6.3.1 質控品：所有藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測都需要選擇一定的質控樣本進行質控分析。質控樣本的選擇視檢測項目而定，如藥物代謝酶的SNP檢測的陰性質控樣本可以是無相關突變的同類樣本和不含任何核酸的水樣本，陽性質控樣本可以為以前檢測過的特定基因突變已知的樣本或體外構建的已含特定突變質粒的細胞株。常用的做法為：在每次檢測時同時設立試劑對照、陰性質控、陽性質控、弱陽性質控，且這些質控樣本與待檢樣本同時進行檢測，每隔一定數量的臨床標本插入一份質控樣本。當同時檢測多個變異位點時，可根據實驗室的條件設立針對2～3個位點的陰性或陽性對照，但不同批次間要注意更換陰性和陽性對照樣品。

質控樣本的質量與實驗結果的可信度密切相關。理想的室內質控樣本應該具有以下特點：基質一致，即與待測樣本具有相同的基質；穩定性好，在適當的儲存條件下能保持較好的穩定性；檢測結果應該是確定的，且越接近試驗的決定性水平越好；具有安全性，不得有生物傳染危險性；單批可大量獲得，以便于長期連續監測。

6.3.2 室內質量控制的方法：應用統計學原理或非統計學方法判斷測定批次的結果是失控還是在控，是室內質控的核心。室內質量控制的方法包括統計學質量控制和非統計學質量控制兩大類。一般而言，定性檢測（如基因分型）采用非統計學質量控制，而定量檢測如基因表達水平檢測、基因甲基化水平測定、以及實驗室“污染”所致的假陽性定量檢測一般采用統計學質控。統計學質控主要從不精密度和偏離度兩個方面確定檢測程序或分析方法穩定性的性能特點，其具體做法是在常規檢測臨床標本時，除陰性質控外，還要對連續的一個濃度梯度的陽性質控樣本進行檢測，分析判斷質控樣本的測定結果是否偏出所用方法的測定范圍，進而決定常規臨床測定標本結果的有效性。統計學質量控制的前提是制定在最佳條件和常規條件下實驗室變異的基線。在進行不精密度測定時，一般至少對20個不同的樣本連續檢測不少于20天，每天2次。偏離度的測定可采用基準線法、與參考物質的檢測結果比較、與其他平行單位的檢測結果比較、與其他方法的檢測結果比較等多種方法。部分定性檢測方法因可計算出樣本中突變等位基因的比例，也可應用統計學質控方法進行質控分析。

統計學質量控制方法主要包括兩大類：陽性樣本測定重復性統計質控方法和假陽性的統計質控方法。陽性質控品測定重復性統計能較準確地反映實驗室儀器、試劑、實驗員操作的穩定性，也是實驗室實時監控檢測結果是否可信的重要手段，其主要統計控制方法包括基線測定、Levey-Jennings質控圖方法、Westgard多規則質控方法、累積和（CUSUM）質控方法及“即刻法”質控方法。假陽性的統計質控方法包括根據日?；颊邫z測結果陽性率的Levey-Jennings質控圖和直接概率計算法兩種，其中Levey-Jennings質控圖法是目前臨床檢驗中應用較為廣泛的一種方法，適合于質控樣本多次重復、檢測結果可用數值表示且呈正態分布的情況。

Levey-Jennings質控圖法的具體做法是：樣本處理（核酸提?。r加入流程陰參，所有步驟與待測樣本一致；加模板時，各檢測位點均應設置陰性對照（即以流程陰參為模板，用于檢測是否發生“污染”）與一定比例的突變型/野生型陽性標準品。PCR擴增時注意前后批次陰參和陽參的孔槽擺放位置的隨機性。所有陰參、陽參的檢測結果應符合預期值，記錄各個陽性質控品PCR擴增產物檢測結果。用Levey-Jennings質控圖進行統計分析，根據質控規則判斷檢測結果是否在控。質控規則如下：

12S：1個質控測定值超出X±2S控制線，預警；13S：1個質控測定值超出X±3S控制線，失控；22S：同一批次2個連續的質控測定值或不同批次的2個質控測定值同時超出X+2S或X-2S控制線，失控；R4S：同一批測定中，2個不同濃度質控物的測定值之間的差值超出4S控制線，失控；41S:4個連續的質控測定值同時超出X+1S或X-1S控制線，失控；7T：7個連續的質控測定值呈現出向上或向下的趨勢，失控；10X：10個連續的質控測定值同時處于均值（X）的同一側，失控。

只有當使用所有質控規則判斷確定測定值在控時的檢測結果方為可信結果，而只要上述質控規則之一判斷測定值失控即認為該測定值失控。陰參檢測結果為陽性，也判定為失控。一旦失控出現，當日所有檢測結果無效，必須暫停實驗并及時查明原因，采取改進措施，直至測定結果在控后方可重新開始臨床檢測。每次出現失控情況需填寫失控記錄，詳細記錄失控原因、采取措施及其效果，失控報告應及時通報公布，以免反復出現同一原因導致的失控。

6.4 室內質量控制的評價：實驗室應有專人對實驗過程各個階段及實驗數據進行質檢。在日常臨床診斷服務過程中，如果發現陽性質控標本結果偏高、偏低或檢測為陰性，或陰性質控品檢測為陽性，則應立刻查找失控原因，并采取預防措施。

陽性質控品失控常見的原因包括：模板問題、引物或探針問題、儀器問題或試劑問題。應對策略包括：純化核酸、高濃度小量分裝、避免核酸反復凍融、換用新的檢測試劑、標本重復雙份測定、對可能含PCR擴增抑制物的標本進行稀釋等。

陰性質控品呈陽性提示核酸“污染”，污染來源可能是擴增產物和（或）核酸提取過程中的交叉污染。如果臨檢標本全為陽性，提示擴增產物或試劑污染，應更換試劑或進行實驗室清潔、通風；如果臨檢標本部分陽性、部分陰性，考慮為擴增產物輕度污染或標本間交叉污染，可通過對5～8份水樣品進行檢測，查明污染來源，陽性提示實驗室污染，則應進行實驗室清潔、通風，陰性要提醒臨檢人員注意操作過程。

6.5 室間質量評價：臨床檢測實驗室應參加室間質量評價（EQA），對待EQA樣本不能特殊化，詳細、如實地記錄參與EQA的全過程，根據反饋結果了解本實驗室的能力，自查存在的問題，及時尋求改進方法，解決問題，完善實驗室質量控制體系，以促進實驗室更好的發展。EQA評分包括絕對評分和相對評分。絕對評分就是看實驗室對該次所有質評樣本檢測結果與預期結果相符的標本總數占該次全部樣本的百分比，大部分項目絕對評分大于80%即可視為檢測結果滿意或合格。藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測的EQA還需對檢測報告的填寫規范程度、文字錯誤、報告清晰度、結果報告揭示的充分性等進行評價。

為保證室間質評的質量，需要注意以下幾點：① 參加質評實驗室報告結果要清楚、簡潔；② 參加質評實驗室使用與常規樣本完全相同的方法來測定室間質控樣本；③ 室間質評報告要迅速及時；④ 室間質評樣本的來源和濃度與臨床患者標本要盡量一致；⑤ 室間質評樣本必須在發放條件下穩定；⑥ 不存在不可避免的傳染危險。

7 制 度

臨床檢驗過程中需遵守國家對醫療機構和臨床檢驗實驗室的其他相關規定。

① 醫療機構及臨床實驗室相關管理條例：《醫療機構管理條例》 《醫療機構臨床實驗室管理辦法》《醫療機構臨床基因擴增管理辦法》《醫療機構臨床檢驗項目目錄》《醫療質量控制中心管理辦法（試行）》《實驗室質量手冊》《醫學檢驗所基本標準（試行）》。

② 標本處理的相關條例：《血站質量管理規范》《血站實驗室質量管理規范》《血液標本留取程序》《血液檢驗樣本目測檢查標準》《血液的貯存發放與運輸管理程序》和《血液樣本接收處理標準操作規程》。

③ 醫療廢物處理的相關條例：《醫療廢物管理制度》。