miR-155在骨髓間充質干細胞成骨分化中的調控作用

楊曉慶 蘇 健

北京市醫療器械檢驗所，北京 100700

miR-155在骨髓間充質干細胞成骨分化中的調控作用

楊曉慶 蘇 健▲

北京市醫療器械檢驗所，北京 100700

目的探討miR-155對骨髓間充質干細胞（BMSCs）向成骨分化能力的影響。 方法從C57/BL6J小鼠骨髓中分離BMSCs，BMSCs按照2×105個/mL的濃度接種，過夜貼壁后進行轉染，通過miR-155模擬劑及miR-155抑制劑改變miR-155在BMSCs中的表達，同時設立miRNA模擬劑的同型對照和miRNA抑制劑的同型對照。采用qRT-PCR檢測不同處理后BMSCs中骨標志基因RUNX2、骨鈣蛋白（OCN）、骨橋蛋白和Ⅰ型膠原（Col-Ⅰ）的表達；通過堿性磷酸酶（ALP）染色和ALP活性分析觀察ALP的表達和酶活性；通過茜素紅染色檢測細胞外鈣鹽結節的形成。 結果地塞米松使miR-155在BMSCs中的表達上調（13.56±0.45）倍（P＜0.01），miR-155在BMSCs向成骨細胞誘導第4天時表達顯著下調 （P＜0.01）。轉染miR-155模擬劑的BMSCs成骨誘導第12天時RUNX2、OCN和Col-Ⅰ的表達明顯低于其同型對照（P＜0.01），ALP活性明顯低于其同型對照（P＜0.01），ALP染色和茜素紅染色的陽性細胞數也明顯少于其同型對照。轉染miR-155抑制劑的BMSCs成骨誘導第12天時RUNX2、OCN和Col-Ⅰ的表達明顯高于其同型對照（P＜0.05或P＜0.01），ALP活性明顯高于其同型對照，ALP染色和茜素紅染色的陽性細胞數也明顯多于其同型對照。結論轉染miR-155模擬劑能夠明顯抑制BMSCs向成骨細胞分化，轉染miR-155抑制劑則能夠明顯促進BMSCs分化為成骨細胞。miR-155作為成骨分化的負性調節分子可能成為骨質疏松癥等成骨分化異常相關疾病的有效干預靶點。

地塞米松；骨髓間充質干細胞；成骨分化；miR-155；骨質疏松癥

骨質疏松癥是一種以骨量減少、骨微結構破壞、骨脆性增加和易骨折為特征的全身代謝性骨病。糖皮質激素性骨質疏松癥是繼發性骨質疏松癥的主要類型[1]，其預防和治療是骨科領域亟待解決的嚴重問題。骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）成骨分化能力下降與骨質疏松癥發生密切相關[2-3]。成骨分化是一個高度有序的調控過程，起始于成骨關鍵轉錄因子RUNX2的活化，導致堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）的表達和活性增高，最終引起以細胞外基質中出現鈣沉積為特征的終末成骨細胞形態的改變。與礦化相關的基因包括骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）、骨橋蛋白和Ⅰ型膠原（Col-Ⅰ）等。microRNA（miRNA）是一類長約22個核苷酸的非編碼RNA分子，通過與靶基因mRNA的堿基配對結合導致其降解或翻譯阻遏。miRNAs在骨質疏松癥中表達異常[4-6]。地塞米松能夠損害BMSCs的成骨分化[7]，高濃度的地塞米松可改變BMSCs中miRNA的表達[8]，目前，miRNAs在地塞米松抑制成骨分化中的作用還不清楚。本研究以小鼠BMSCs向成骨細胞分化為模型，研究地塞米松誘導高表達的miR-155對BMSCs成骨分化能力的影響，為臨床上糖皮質激素性骨質疏松癥的預防和治療提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

DMEM培養液、小鼠BMSCs培養液、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素購于美國Gibco公司；β-甘油磷酸鈉、地塞米松、Vit C和茜素紅均購于美國Sigma公司；ALP染色試劑盒購于中國醫學科學院血液學研究所；ALP活性測定試劑盒購于南京建成生物制品有限公司；脂質體2000轉染試劑及轉染用培養液opti-MEM購于Invitrogen公司；miR-155模擬劑及抑制劑由上海吉瑪生物制藥有限公司合成。

1.2 小鼠骨髓MSCs的分離培養

C57/BL6J小鼠，清潔級，8周齡，雌雄各半，共20只，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動物合格證號：SCXK（京）2009-0004。C57/BL6J小鼠斷頸處死，在無菌條件下分離雙側股骨，剪去干髓端，剔除附著的肌肉和結締組織，然后用1 mL注射器吸取小鼠BMSCs培養液5 mL沖洗股骨髓腔，收細胞懸液，吹打均勻后調整細胞濃度為5×105個/mL接種于T25培養瓶中，于37℃，5%CO2條件下培養，24 h后去除未貼壁的懸浮物，換新鮮小鼠BMSCs培養液繼續培養，待細胞匯合度約達90%時，以0.25%的胰蛋白酶消化，按照1∶3的比例傳代培養。

1.3 BMSCs的成骨誘導分化及鑒定

成骨誘導分化體系參照文獻[8]進行。成骨分化的鑒定：ALP染色及ALP活性實驗鑒定早期成骨分化，茜素紅染色鑒定晚期成骨分化形成的細胞外鈣鹽沉積物；qRT-PCR檢測成骨相關基因RUNX2、OCN和Col-Ⅰ的相對表達量。

1.3.1 成骨誘導體系 取第3代BMSCs過夜貼壁后，待細胞長到70%～80%的匯合度時，加入成骨誘導液（DMEM基礎培養液中含有50 μg/mL的Vit C、10 mmol/L的β-甘油磷酸鈉、1 nmol/L的地塞米松）繼續培養，每隔2 d換新鮮誘導液，同時設立未加地塞米松處理的對照BMSCs。

1.3.2 ALP染色 按照ALP染色試劑盒說明書操作。BMSCs成骨誘導12 d時終止誘導，用平衡鹽溶液洗細胞2次，用4%多聚甲醛溶液固定細胞10 min，棄固定液，每孔加入數滴新鮮配制的ALP染色液，37℃染色2 h，流水沖洗，光鏡下觀察并拍照。拍照時放大倍數為200倍。

1.3.3 ALP活性分析 根據ALP活性測定試劑盒，通過ELISA方法，用堿性磷酸酶黃色（pNPP）液體底物系統對ALP活性進行測定。以細胞裂解物的總蛋白量對ALP活性進行標準化。紫外分光光度計測定405 nm波長處的吸光度值，并按照公式計算ALP活性值，ALP活性（U/gprot）=[（測定管吸光度值/標準管吸光度值）×標準管對硝基酚量]/總蛋白克數。

1.3.4 茜素紅染色 按照試劑說明書進行操作。BMSCs成骨誘導分化16 d終止誘導，用平衡鹽溶液洗細胞2次，用75%乙醇溶液固定10 min，棄固定液，每孔加入500 μL的0.1%茜素紅-Tris-HCL染色液（pH=8.2）染色30 min，蒸餾水沖洗后，光學顯微鏡下觀察并拍照。拍照時放大倍數為200倍。

1.4 miR-155模擬劑和抑制劑的瞬時轉染

BMSCs按照2×105個/mL的濃度接種，過夜貼壁后進行轉染，分別轉染miR-155模擬劑及miR-155抑制劑，同時設立miRNA模擬劑的同型對照和miRNA抑制劑的同型對照。具體操作按照脂質體2000試劑盒（Invitrogen）說明書進行，轉染后細胞放37℃培養箱培養6 h后，吸除轉染液，換新鮮培養液或成骨誘導液繼續培養。

1.5 總RNA提取、逆轉錄及qRT-PCR檢測成骨基因的表達

收集細胞，用Trizol（Invitrogen）提取總RNA，按照miScript Reverse Transcription Kit（QIAGEN）操作說明書進行逆轉錄。按照SYBR GreenⅠ試劑盒（TaKaRa）說明書進行qRT-PCR。在Stepone Plus熒光定量PCR儀（美國ABI公司）上進行qRT-PCR反應。反應條件：95℃預變性30 s；95℃變性10 s，60℃退火40 s，循環35次。mRNA檢測以GAPDH為內參照。miRNA檢測以U6為內參照。U6的逆轉錄引物為5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAC TGGATACGACAAAATA-3'，PCR引物上游為5'-TCCGATCGTGAAGCGTTC-3'，下游為5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。目的基因和miRNA的相對表達量采用2-ΔΔCt法進行分析。每組實驗重復3次。

1.6 統計學方法

采用SPSS 22.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（）表示，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BMSCs向成骨誘導分化及鑒定

流式細胞術檢測BMSCs表型為CD29、CD44和CD106陽性，CD31和CD34陰性。成骨誘導第12天，ALP染色顯示成骨誘導的細胞被染成藍色（圖1A，封四）。成骨誘導第16天，茜素紅染色顯示成骨誘導的細胞外基質中形成許多橘色、橘紅色鈣鹽結節 （圖1B，封四）。qRT-PCR分析顯示，以誘導0天的表達值為對照，成骨分化關鍵轉錄因子RUNX2在誘導第4天表達上調達（2.11±0.22）倍（P＜0.05），在誘導第8天表達最高，達（11.70±0.12）倍（P＜0.01）；成骨分化晚期標志基因OCN和Col-Ⅰ于誘導第8天表達上調分別達（1.83±0.06）倍和（3.46±0.41）倍（P＜0.01），到第 16天持續顯著上調分別達 （9.49±0.91）倍和（15.06±1.46）倍（P＜0.01）（圖2）。

2.2 miR-155模擬劑對BMSCs成骨分化的影響

2.2.1 地塞米松對miR-155表達的影響及miR-155在成骨分化中的表達 高濃度地塞米松培養BMSCs 2 d后，miRNA特異性qRT-PCR分析顯示，與未經地塞米松處理的對照BMSCs比較，高濃度地塞米松培養使BMSCs中miR-155表達上升（13.56±0.45）倍（P＜0.01）（圖3A），miR-155在BMSCs向成骨細胞誘導的第4天表達下降（0.25±0.02）倍（P＜0.01）（圖3B）。

2.2.2 miR-155模擬劑對成骨相關基因的影響 以miR-155模擬劑和其同型對照瞬時轉染BMSCs，24 h后qRT-PCR顯示，與miRNA模擬劑的同型對照比較，miR-155模擬劑轉染使BMSCs中miR-155表達上調達（23.88±1.64）倍（P＜0.01）（圖3C）。miR-155模擬劑轉染BMSCs 24 h后進行成骨誘導，誘導第12天時qRT-PCR分析顯示，與miRNA模擬劑的同型對照比較，miR-155模擬劑成骨相關基因RUNX2的表達量從（11.72±1.63）下降到（4.06±0.80）（P＜0.01），OCN從（6.31±0.56）下降到（2.14±0.27）（P＜0.01），Col-Ⅰ從（15.56±1.39）下降到（2.14±0.27）（P＜0.01）（圖3D）。

2.2.3 miR-155模擬劑對ALP表達及活性的影響

成骨誘導第12天ALP染色顯示，miR-155模擬劑ALP染色陽性細胞明顯少于其同型對照 （圖4A，封四）。ALP活性分析顯示miR-155模擬劑的ALP活性明顯低于其同型對照（P＜0.01）（圖4B，封四）。

2.2.4 miR-155模擬劑對細胞外鈣化基質形成的影響 成骨誘導第16天茜素紅染色顯示，miR-155模擬劑形成的橘紅色細胞外礦化基質明顯少于其同型對照（圖4C，封四）。

2.3 miR-155抑制劑對BMSCs成骨分化的影響

圖2 qRT-PCR檢測成骨基因表達

2.3.1 miR-155抑制劑轉染效率及抑制效率鑒定miR-155的抑制劑和其同型對照瞬時轉染BMSCs 24 h后，qRT-PCR測定顯示，與miRNA抑制劑的同型對照比較，miR-155的抑制劑轉染使BMSCs中miR-155表達下降（0.28±0.03）倍（P＜0.01）（圖5A）。

2.3.2 miR-155抑制劑對成骨標志基因的影響 miR-155抑制劑轉染BMSCs，24 h后進行成骨誘導分化，誘導第12天時qRT-PCR分析顯示，與miRNA抑制劑的同型對照比較，轉染miRNA抑制劑的成骨細胞中成骨分化關鍵轉錄因子RUNX2的相對表達量從（8.97±0.40）上升到（17.35±1.02）（P＜0.01），OCN的相對表達量從（5.14±0.12）上升到（9.72±0.99）（P＜0.05），Col-Ⅰ的相對表達量從 （9.33±1.09）上升到（18.58± 1.01）（P＜0.05）（圖5B）。

2.3.3 miR-155抑制劑對ALP染色和活性的影響

成骨誘導第12天，ALP染色顯示，miR-155抑制劑的ALP染色陽性的細胞數明顯多于其同型對照（圖6A，封四）。ALP活性分析顯示，轉染miR-155抑制劑的成骨細胞中ALP活性明顯高于其同型對照 （P＜0.01）（圖6B，封四）。

2.3.4 miR-155抑制劑對細胞外鈣化基質形成的影響 成骨誘導第16天茜素紅染色顯示，轉染miR-155抑制劑后形成的橘紅色細胞外礦化基質明顯多于其同型對照（圖6C，封四）。

3 討論

激素性骨質疏松癥是臨床繼發性骨質疏松癥的最常見類型[7-9]。大量應用糖皮質激素可刺激脂肪分化，抑制成骨分化，降低骨形成速率以及骨密度，導致骨質疏松[10-15]。作為最常見糖皮質激素之一，地塞米松能激活BMSCs表面的糖皮質激素受體，導致BMSCs向脂肪分化，減少其向成骨細胞分化[9-15]。

圖3 過表達miR-155促進成骨分化

圖5 下調miR-155表達促進成骨分化

最近大量的研究發現，miRNAs在調控成骨細胞分化中發揮重要作用[16-18]，而地塞米松導致BMSCs中miRNAs的表達明顯改變。miRNA芯片分析發現，較高濃度的地塞米松處理后導致BMSCs中包括miR-155在內的9個miRNAs表達明顯上調[8]。地塞米松是否通過誘導這些miRNAs表達來發揮其對成骨分化的抑制作用目前還不清楚。與文獻報道的結果相一致[8]，本研究結果也提示，地塞米松能夠明顯上調BMSCs中miR-155的表達。進一步研究發現miR-155在調控BMSCs向成骨細胞分化中發揮重要作用，miR-155能夠明顯抑制BMSCs的成骨分化，表現為成骨相關基因的抑制，ALP染色陽性率和ALP活性的明顯下降，細胞外形成的鈣化結節數量明顯減少。而將BMSCs中內源性miR-155的表達抑制后能夠明顯促進BMSCs向成骨細胞的分化。提示，地塞米松可能通過上調miR-155及其他一些miRNAs的表達，發揮其抑制成骨分化的作用。

miR-155最早作為癌基因被發現與細胞增殖和炎性反應相關。在EB病毒陽性的B細胞株中，miR-155能夠通過靶向一系列BMP信號通路級聯分子SMAD1、SMAD5、RUNX2等，抑制BMP2、BMP6和BMP7誘導的ID3表達[18]。在融合性大B細胞淋巴瘤中，miR-155被發現能夠直接靶向BMP反應性轉錄因子Smad5，調控細胞周期阻滯[19]。在MC3T3-E1中抑制miR-155的表達能夠部分減輕腫瘤壞死因子-α對BMP-2誘導成骨分化的抑制作用[20]。在BMSCs中miR-155是否通過調控BMP/Smads通路發揮抑制成骨分化的作用還有待進一步研究。

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Regulation effect of miR-155 in the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells

YANG Xiaoqing SU Jian▲
Beijing Institute of Medical Device Testing，Beijing 100700，China

Objective To investigate the effect of miR-155 on the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs).Methods BMSCs were isolated from C57/BL6J cultured mouse,and were inoculated according to the concentration of 2×105/mL,then BMSCs were transfected by miR-155 mimics and miR-155 inhibitors after the cells sticking wall,at the same time,the same type of contrast were set up.The expression of marker gene in BMSCs, such as RUNX2,OCN and Col-Ⅰwere detected by qRT-PCR after different transfection;the expression of ALP and enzyme activity were determined by ALP staining，and ALP activity assay;extracellular calcium nodule formation was assessed by alizarin red staining.Results miR-155 was up-regulated at（13.56±0.45）folds（P＜0.01）in dexamethasone-treated BMSCs，and its expression was significantly elevated at day 4 of osteogenic differentiation in BMSCs（P＜0.01）.The expression levels of osteogenic-related genes RUNX2，OCN and Col-Ⅰ，ALP activity in miR-155 mimictransfected BMSCs after induction for 12 days were significantly lower than the control of miR-155 mimic（P＜0.01），and the number of positive cell after ALP staining and alizarin red staining were significantly less than the control of miR-155 mimic.In contrast，the expression levels of RUNX2，OCN and Col-Ⅰ increased in miR-155 inhibitorstransfected BMSCs after induction for 12 days（P＜0.05 or P＜0.01）;the activity of ALP were significantly higher than the control of miR-155 inhibitors（P＜0.01）,and the number of positive cell after ALP staining and alizarin red staining were significantly more than the control of miR-155 inhibitors.Conclusion The osteoblastic differentiation of BMSCs can remarkably inhibit by miR-155 mimic transfection and significantly promoted by miR-155 inhibitor transfection.As a novel negative regulator in osteogenic differentiation，miR-155 may be an effective intervention targets for osteoporosis and other osteogenic differentiation disorder-related diseases.

Dexamethasone;Bone marrow mesenchymal stem cells;Osteogenic differentiation;miR-155;Osteoporosis

R68

A

1673-7210（2015）11（c）-0038-05

2015-08-05本文編輯：任 念）

▲通訊作者