全反式維甲酸聯合5-氟尿嘧啶對ECA109細胞增殖、遷移和VEGF表達的影響*

李珊珊，羅忠民，崔會娟，王珍珍，彭 湃，李 娜，路太英#

1)鄭州大學第一附屬醫院腫瘤科 鄭州450052 2)焦作市第二人民醫院腫瘤科 焦作454002

食管癌是發病率高、預后較差的實體瘤之一。食管癌患者在診斷時多數已屬于晚期，失去手術治療的機會［1］，目前主要采用化療聯合放療等綜合治療方式，而化療往往引起諸多毒副反應導致治療效果欠佳。近年研究［2］表明，誘導分化治療已成為一種重要的腫瘤治療方法，其中全反式維甲酸(AT-RA)是目前誘導分化劑中最重要并已用于臨床的藥物。5-氟尿嘧啶(5-FU)是消化系統常用化療藥物，但是逐漸出現的耐藥卻限制了其臨床應用，因此臨床上主張聯合用藥。有研究［3］顯示，ATRA 和5-FU聯合應用對食管癌細胞有協同抑制生長和誘導凋亡作用，但具體機制尚不完全清楚。該研究通過體外實驗觀察ATRA 聯合5-FU 對食管腫瘤血管生成的影響，探討兩者抑制腫瘤細胞生長的可能機制，為提高食管癌的療效提供理論依據。

1 材料與方法

1．1 主要藥物和試劑 DMEM 培養基、DMSO 均購自北京索萊寶科技有限公司，胎牛血清為杭州四季青公司產品，ATRA(用無水乙醇配制成1 000 μmol/L 的儲備液，4℃避光保存)、MTT 均購自Sigma 公司，5-FU 購自上海旭東海普藥業有限公司，兔抗人血管內皮生長因子(VEGF)抗體、即用型SABC 免疫組化染色試劑盒及DAB 顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司，Trizol 由美國Invitrogen 公司生產，逆轉錄試劑盒購自日本TaKaRa 公司，PCR試劑購自北京康為世紀生物技術有限公司，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1．2 細胞培養和實驗分組 Eca109 細胞由中國醫學科學院腫瘤醫院分子腫瘤學國家重點實驗室贈送。Eca109 細胞單層貼壁生長于含體積分數10%胎牛血清的DMEM 培養液中，37℃、體積分數5%CO2培養箱中常規培養，隔日換液，取對數生長期細胞進行實驗。常規傳代的Eca109 細胞分為4組:ATRA組(ATRA 終濃度為5 μmol/L)、5-FU組(5-FU 終濃度為50 mg/L)、ATRA +5-FU組(ATRA 終濃度為5 μmol/L，5-FU 終濃度為50 mg/L)和對照組(僅含Eca109 細胞)。

1．3 MTT 法檢測各組細胞生長抑制率 取對數生長期細胞，胰蛋白酶消化后調整細胞密度為3 ×104mL－1，接種于96 孔培養板內，每孔200 μL，貼壁后按1．2 分組并進行處理。每組設5個平行孔。分別培養24、48、72 h 后，每孔加入MTT 液(5 g/L)20 μL。繼續孵育4 h 后棄去孔內上清液，每孔加100 μL DMSO，振蕩搖勻。選擇490 nm 波長，酶聯免疫檢測儀上測定各孔吸光度(A)值，計算細胞生長抑制率，細胞生長抑制率=(1 －實驗組A 值/對照組A值)×100%。

1．4 劃痕實驗檢測各組細胞的遷移能力 取對數生長期細胞，胰蛋白酶消化后以5 ×105個/孔接種于6 孔板中，作用24 h 后，用無菌槍頭沿細胞中部劃一條直線，按1．2 進行分組和處理。每組設3個平行孔。分別在0、24 h 拍照，用圖像處理軟件測量劃痕寬度，計算遷移率，遷移率=(1 －實驗組劃痕寬度/對照劃痕寬度)×100%。

1．5 RT-PCR 法檢測各組細胞VEGF mRNA 表達情況 收集經不同處理組作用48 h 后的細胞，提取細胞總RNA，按逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄獲得cDNA。VEGF(產物大小350 bp)上游引物:5'-AGGGCAGAATCATCACGAAG-3';下游引物:5'-CCTTTCCCTTTCCTCGAACT-3';內參GAPDH(產物大小504 bp)上游引物:5'-TGATTCCACCCATG GCAAATTCC-3';下游引物:5'-ACAGCCTTGG CAGCGCCAGTAGA-3'。將引物與逆轉錄產物在50 μL 體系中進行擴增。反應條件:94℃預變性4 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環30次;最后72℃延伸10 min。循環完成后取10 μL PCR 產物在10 g/L 瓊脂糖凝膠中電泳后，采用凝膠成像儀進行掃描拍照，用Gel Analyzer 軟件進行灰度值分析，以VEGF 條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值之比作為VEGF mRNA 的相對表達量。實驗重復3次。

1．6 免疫細胞化學法(SABC 法)檢測各組細胞VEGF 蛋白表達情況 按1．2 分組制作細胞爬片，加藥后培養48 h 取出，40 g/L 多聚甲醛固定30 min，體積分數0．2% Trixton-100 處理15 min，體積分數3% H2O2室溫處理10 min，用試劑盒中的血清封閉液在37℃封閉20 min，加入一抗(1∶300 稀釋，兔抗人)4℃過夜，將PBS 代替一抗作為陰性對照;二抗孵育20 min，SABC 37℃孵育20 min，PBS反復漂洗，DAB 顯色10 min，自來水沖洗，蘇木素復染15 s，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。鏡下觀察，每組細胞選取3 張爬片，采用病理圖像分析軟件進行半定量分析，以灰度值作為VEGF 蛋白的相對表達量。

1．7 統計學處理 采用SPSS 17．0 進行數據分析。不同組間細胞生長抑制率的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗;不同組間遷移率、VEGF mRNA 及蛋白相對表達量的比較采用2 ×2析因設計的方差分析。檢驗水準α=0．05。

2 結果

2．1 各組細胞生長抑制率的比較 結果見表1。

2．2 各組細胞遷移率的比較0h時各組細胞遷移率均為0．00%。見表2、圖1。

表1 各組細胞生長抑制率的比較(n=5) %

表2 各組細胞遷移率的比較(n=3) %

圖1 不同處理對Eca109 細胞遷移能力的影響(×200)

2．3 各組細胞VEGF mRNA 和蛋白表達情況VEGF 蛋白陽性表達:呈棕黃或棕褐色顆粒狀，主要分布于細胞質，核膜亦可見表達。見圖2、表3 和圖3。

圖2 各組細胞VEGF mRNA 表達情況

表3 各組細胞VEGF mRNA 和蛋白表達情況(n=3)

圖3 各組細胞VEGF 蛋白表達情況(SABC，×400)

3 討論

5-FU 是臨床常用抗腫瘤藥物，但其毒副作用限制了其在臨床上的應用［4］。誘導分化治療最初是由Pierce 等［5］提出。分化誘導劑調節腫瘤細胞分化，使腫瘤細胞轉化為正常細胞或導致細胞凋亡，可以改善腫瘤患者的預后，為腫瘤的化學藥物治療提供一個新領域。ATRA 作為重要的誘導分化劑之一，臨床研究比較廣泛。近年來，諸多學者［6-10］發現其在抑制實體腫瘤細胞增殖、促進細胞分化和凋亡方面有重要作用，但具體機制尚不明確。VEGF 在多種實體瘤組織中均有表達，在食管癌組織中的表達率可達65%，細胞株中可達100%［11］。實驗［12-14］表明ATRA 具有抑制多種腫瘤細胞分泌VEGF 的作用。Zage 等［15］研究表明，ATRA 可抑制神經母細胞的VEGF-R，降低血管通透性，抑制內皮細胞分裂、增殖和遷移，從而抑制腫瘤細胞增殖。有研究［16］發現，5-FU 對HepG2 肝癌細胞中VEGF 的表達具有抑制作用。

該研究結果顯示，ATRA 和5-FU 聯合作用于Eca109 細胞后，細胞生長抑制率明顯高于各單藥作用組及對照組;RT-PCR 及免疫細胞化學法檢測結果也提示，ATRA、5-FU 單藥作用均能下調VEGF mRNA 和蛋白的表達，且兩者聯合應用下調作用更為明顯。由此提示，ATRA、5-FU 均可抑制Eca109細胞的生長，并且可能與其下調VEGF mRNA 和蛋白表達有關?；趯嶒灲Y果可以看出，兩者聯合應用可以通過下調VEGF 的表達抑制腫瘤血管生成從而抑制細胞生長，增強化療療效。因此，化療聯合誘導分化劑ATRA 為食管癌的防治帶來一定的希望，為ATRA 在臨床上的應用提供一定的實驗依據。

［1］曹秀峰，李蘇卿．微小RNA 在食管癌診斷預后及治療中的作用［J］．中華腫瘤雜志，2011，33(3):161

［2］Spira AI，Carducci MA．Differentiation therapy［J］．Curr Opin Pharmacol，2003，3(4):338

［3］路太英，李鑫，李文斌，等．全反式維甲酸對食管癌EC9706 細胞系化療敏感性的影響［J］．中華腫瘤雜志，2010，32(9):663

［4］Afzal S，Gusella M，Vainer B，et al．Combinations of polymorphisms in genes involved in the 5-fluorouracil metabolism pathway are associated with gastrointestinal toxicity in chemotherapy-treated colorectal cancer patients［J］．Clin Cancer Res，2011，17(11):3822

［5］Pierce GB，Speers WC．Tumors as caricatures of the process of tissue renewal:prospects for therapy by directing differentiation［J］．Cancer Res，1988，48(8):1996

［6］Abu J，Batuwangala M，Herbert K，et al．Retinoic acid and retinoid receptors:potential chemopreventive and therapeutic role in cervical cancer［J］．Lancet Oncol，2005，6(9):712

［7］Pasquali D，Rossi V，Bellastella G，et al．Natural and synthetic retinoids in prostate cancer［J］．Curr Pharm Des，2006，12(15):1923

［8］Coelho SM，Vaisman M，Carvalho DP．Tumour re-differentiation effect of retinoic acid:a novel therapeutic approach for advanced thyroid cancer［J］．Curr Pharm Des，2005，11(19):2525

［9］Alisi A，Leoni S，Piacentani A，et al．Retinoic acid modulates the cell-cycle in fetal rat hepatocytes and HepG2 cells by regulating cyclin-cdk activities［J］．Liver Int，2003，23(3):179

［10］路太英，楊成梁，王留興，等．全反式維甲酸對EC9706細胞體外增殖抑制及誘導凋亡作用［J］．鄭州大學學報:醫學版，2008，43(6):1090

［11］Li Z，Shimada Y，Uchida S，et al．TGF-alpha as well as VEGF，PD-ECGF and bFGF contribute to angiogenesis of esophageal squamous cell carcinoma［J］．Int J Oncol，2000，17(3):453

［12］Wu J，Hansen JM，Hao L，et al．Retinoic acid stimulation of VEGF secretion from human endometrial stromal cells is mediated by production of reactive oxygen species［J］．JPhysiol，2011，589(Pt 4):863

［13］Zhang JP，Chen XY，Li JS．Effects of all-trans-retinoic on human gastric cancer cells BGC-823［J］．J Dig Dis，2007，8(1):29

［14］Hameed DA，El-Metwally TH．The effectiveness of retinoic acid treatment in bladder cancer:impact on recurrence，survival and TGF alpha and VEGF as end-point biomarkers［J］．Cancer Biol Ther，2008，7(1):92

［15］Zage PE，Zeng L，Palla S，et al．A novel therapeutic combination for neuroblastoma:the vascular endothelial growth factor receptor/epidermal growth factor receptor/rearranged during transfection inhibitor vandetanib with 13-cis-retinoic acid［J］．Cancer，2010，116(10):2465

［16］曲艷紅，楊家梅．5-氟尿嘧啶對HepG2 肝癌細胞系中膜聯蛋白和血管內皮生長因子表達的影響［J］．中華消化雜志，2012，32(2):128