五倍子酸對人纖維肉瘤HT1080細胞增殖和凋亡的影響*

王麗萍，丁 一，劉國紅，石 卓

1)鄭州大學基礎醫學院組織學與胚胎學教研室 鄭州450001 2)吉林大學基礎醫學院藥理學教研室 長春130021

△女，1977年9月生，碩士，講師，研究方向:腫瘤藥理學，E-mail:lp．wang918@126．com

纖維肉瘤是一種最常見的惡性骨腫瘤，目前臨床上主要采用手術治療，但纖維肉瘤具有手術切除后易復發等缺點。藥物治療在纖維肉瘤的治療中也具有重要作用。五倍子酸(gallic acid，GA)是一種廣泛存在于植物中的多酚類化合物［1］，有學者［2-3］已證實其具有較廣泛的藥理作用，在抗腫瘤方面的作用逐漸引起人們的關注。目前，GA 抗纖維肉瘤的作用尚無相關報道。作者以人纖維肉瘤HT1080細胞為實驗材料，應用MTT 及流式細胞術觀察GA對HT1080 細胞增殖及凋亡的影響，應用免疫組化技術觀察其對Bcl-2 和Bax 蛋白表達的影響，探索GA 抗腫瘤作用的可能機制。

1 材料與方法

1．1 材料 HT1080 細胞株購自吉林省腫瘤研究所，用含體積分數10%胎牛血清的DMEM 培養液傳代培養，待細胞生長到對數生長期時使用。GA 購自Sigma 公司，用二甲基亞砜(DMSO)溶解。MTT 購自Sigma 公司，胎牛血清購自杭州四季青生物公司，青霉素、鏈霉素和DMEM 培養基購自Gibco 公司。

1．2 GA 體外對HT1080 細胞生長抑制作用的MTT 法測定 取處于對數生長期的HT1080 細胞，調整密度為1 ×105mL－1，接種于96 孔細胞培養板，24 h 后，分別加入不同質量濃度的藥物，使其終質量濃度分別為3．125、6．250、12．500、25．000、50．000和100．000 mg/L，另設只加培養液的空白對照組;每組3 復孔，置37℃、體積分數5% CO2和100%濕度的培養箱中培養48 h。每孔加入5 g/L 的MTT溶液20 μL，繼續培養4 h。每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min。酶標儀570 nm 波長處測各孔吸光度(A)值，按下式計算細胞抑制率:細胞抑制率=(1 －A給藥孔/A對照孔)×100%。

1．3 GA 體外對HT1080 細胞凋亡的影響 接種對數生長期的HT1080 細胞于6 孔板中，培養24 h，加入GA，使其終質量濃度分別為6．250、12．500 和25．000 mg/L，以只加培養液的為對照組。培養48 h，收集細胞，離心，棄上清。PBS 離心，洗滌2次。加入體積分數70%冷乙醇4℃固定12 h，離心洗滌后，加入200 μL PI 染液、50 μL RNA 酶，4℃避光放置20～30 min，1 500 r/min 離心5 min，調整細胞密度為(1～10)×105mL－1，上流式細胞儀進行分析。

1．4 GA 體外對HT1080 細胞中Bcl-2 和Bax 蛋白表達的影響 將HT1080 細胞培養在內有潔凈蓋玻片的6 孔板中，制備細胞爬片。待其生長到對數生長期時，實驗組用質量濃度分別為6．250、12．500 和25．000 mg/L 的GA 處理，每組均設10個復孔。作用48 h 后，按說明書進行Bcl-2 和Bax 免疫細胞化學染色，以PBS 代替一抗作陰性對照，一抗均按1∶200稀釋，DAB 顯色。Bcl-2 和Bax 蛋白陽性信號呈棕黃色顆粒樣物質，定位于細胞質或細胞膜。免疫細胞化學結果的判定:觀察10個高倍視野，按陽性細胞數＜10%、10%～、30%～和70%～分別計為1、2、3、4 分;按著色強度:胞質內可見淺色顆粒、明顯高于背景底色計為1 分，胞質內見較深顆粒計為2 分，胞質內有大量深色顆粒為3 分。上述兩種計分的乘積為最后得分。

1．5 統計學處理 采用SPSS 15．0 進行分析。應用單因素方差分析及Dunnet t 檢驗比較各組細胞抑制率、凋亡率及Bcl-2 和Bax 蛋白表達的差異，檢驗水準α=0．05。

2 結果

2．1 GA 對HT1080 細胞的生長抑制作用 不同質量濃度(3．125、6．250、12．500、25．000、50．000 和100．000 mg/L)的GA 對HT1080 細胞增殖的抑制率分別為(38．68 ± 3．78)%、(49．87 ± 2．62)%、(61．93 ±4．16)%、(68．34 ± 1．91)%、(76．30 ±3．39)%和(80．20 ±2．12)%，其對HT1080 細胞以劑量依賴的方式抑制其增殖(F = 71．214，P＜0．001)。

2．2 GA 對HT1080 細胞凋亡的影響 隨著GA 質量濃度(0．000、6．250、12．500 和25．000 mg/L)的增加，HT1080 細胞的凋亡率增加［(1．57 ±0．72)%、(11．54 ±2．25)%、(25．46 ±1．14)%和(29．35 ±3．27)%］(F=52．217，P＜0．001)。

2．3 各組細胞Bcl-2 和Bax 蛋白的表達 見圖1、2和表1。與對照組相比，6．250、12．500 和25．000 mg/L GA組Bcl-2 蛋白表達均減弱，而Bax 蛋白的表達均增強。

圖1 GA 作用HT1080 細胞48 h 后免疫細胞化學方法顯示Bcl-2 蛋白表達變化(×200)

圖2 GA 作用HT1080 細胞48 h 后免疫細胞化學法顯示Bax 蛋白表達變化(×200)

表1 4組細胞中Bcl-2 和Bax 蛋白表達的比較

3 討論

細胞凋亡是一種主動的受基因調控的細胞自殺過程。bcl-2 家族是目前研究最深入的凋亡調控基因，其中bcl-2 和bax 在決定凋亡與否的過程中發揮著至關重要的作用［4-6］。bcl-2 是凋亡抑制基因，bax基因作為bcl-2 基因家族的成員，表達的Bax 蛋白與Bcl-2 蛋白以異源二聚體形式存在，它的生物學效應主要是拮抗Bcl-2，促進細胞凋亡的發生。Bcl-2 蛋白家族成員抑制細胞凋亡的功能，使細胞凋亡和存活達到一個相對平衡狀態。Bax 的高表達、Bcl-2 的低表達作用于線粒體，導致線粒體膜通透性轉運孔開放，外膜破壞引起線粒體膜通透性增加，細胞色素C、Smac 等凋亡相關分子大量釋放到細胞質，可以活化Caspase-9，再引起下游的Caspase-3 激活，引起細胞凋亡［7-9］。

研究［10］報道GA 有誘導4種人肺腫瘤細胞(小細胞瘤SBC-3 細胞、鱗狀細胞癌EBC-1 細胞、腺癌A549 細胞和耐順鉑亞克隆小細胞癌SBC-3/CDDP細胞)凋亡的作用，并且GA 誘導細胞凋亡的敏感性不隨順鉑耐藥性而改變。還有學者［11］發現GA 對卵巢癌SKOV3 細胞具有明顯的增殖抑制作用，并可誘導其凋亡。作者［12］的研究顯示在同等劑量下GA的抑瘤效應不如環磷酰胺，但與環磷酰胺相比，GA有兩個優點:一方面GA 對腫瘤細胞具有選擇性，另一方面GA 對動物的整體毒性低。這些特點均顯示了GA 作為抗腫瘤藥物的良好應用前景。

該實驗在前期工作的基礎上，以人纖維肉瘤HT1080 細胞為對象，探討GA 是否能夠在體外抑制HT1080 細胞的生長，以及抑制其生長的可能機制。MTT 結果表明，GA 具有體外抑制HT1080 細胞生長的作用。流式細胞術檢測結果顯示隨著GA 質量濃度的增高，HT1080 細胞的凋亡率也增高，提示GA可能是通過誘導HT1080 細胞的凋亡來抑制其增殖。進一步應用免疫細胞化學方法檢測凋亡蛋白Bax 和Bcl-2 的表達，結果顯示:與對照組相比，應用GA組Bax 蛋白的表達增強，而Bcl-2 蛋白的表達減少。

綜上所述，GA 在體外具有較好的抑制人纖維肉瘤HT1080 細胞生長的作用，GA 可能通過上調Bax 和下調Bcl-2 的表達，介導其誘導的HT1080 細胞凋亡。作者的實驗結果為GA 的應用提供了一定的實驗資料，但體外實驗無法預測GA 在體內的作用，因此還需要從動物體內實驗及臨床流行病學等方面進一步研究。

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