珍稀瀕危藥用植物大花杓蘭的研究現狀

付亞娟　喬潔　侯曉強

摘要：大花杓蘭是珍稀瀕危藥用植物，大花杓蘭資源的保護和再生引起了國內外學者的廣泛關注。為及時把握大花杓蘭的研究現狀和最新研究成果，以1997—2014年國內外關于大花杓蘭的研究論文為基礎，對其基礎生物學、繁殖生物學、授粉生物學、植物菌根共生機制、瀕危機制、保護策略等方面的研究成果進行總結與分析。

關鍵詞：大花杓蘭；人工繁殖；研究現狀

中圖分類號： S567.23+9.01 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0328-04

大花杓蘭（Cypripedium macranthos）是蘭科杓蘭屬的多年生草本植物。近年來，由于人為過度采挖及其生存環境的破壞，致使大花杓蘭野生種群的數量急劇減少，總體處于瀕危狀態[1]。大花杓蘭極具觀賞價值和藥用價值，其研究引起了國內外學者的普遍關注。大花杓蘭種子細小，缺乏為其萌發提供營養的器官-胚乳，在自然條件下很難萌發。只有在適宜的溫度、濕度等條件下，遇到特異的真菌并與之建立共生關系才能促進種子萌發[2]。目前，大花杓蘭種子的非共生萌發、與真菌共生萌發、快速繁殖技術已取得一定進展，但仍處于少量微繁殖（micropropagation）階段，其原因在于原球莖誘導率低、褐化死亡率高、幼苗生長緩慢、幼苗移栽成活率低。以1997—2014年國內外發表的研究論文為基礎，對大花杓蘭的研究現狀進行分析和評述，有助于及時了解和掌握我國大花杓蘭的研究水平、優勢、不足，對豐富與拓展大花杓蘭的研究領域具有重要意義。

1 文獻來源及方法

通過中文期刊數據庫（CNKI），以“大花杓蘭”為檢索詞進行全文檢索，獲得1997—2014年關于大花杓蘭的中文文獻；通過NCBI PubMed、Science Direct、Springerlinker外文期刊數據庫，以“Cypripedium macranthos”為檢索詞檢索1997—2014年關于大花杓蘭的外文文獻，并去掉3個數據庫中重復的論文。采用Excel軟件進行文獻相關的數據分析。

2 大花杓蘭的研究概況及主要研究方向

自1997—2014年18年期間，國內外學者共發表大花杓蘭研究論文31篇，其中中文期刊論文17篇、SCI收錄論文14篇。研究論文發表數量較少，表明大花杓蘭的研究剛剛起步，基礎較為薄弱。在SCI論文中，日本學者發表多達11篇，中國學者發表2篇，韓國學者僅發表1篇，表明大花杓蘭的研究主要以日本、我國為主，這與大花杓蘭自然分布于俄羅斯、朝鮮半島、我國、日本[3]密切相關。自2009年后，我國學者在國內外刊物發表大花杓蘭研究論文的數量不斷增加，目前為止共發表論文19篇，其中SCI收錄2篇，表明我國大花杓蘭的研究起步更晚，近10年才引起普遍關注并處于平穩發展時期。華北和東北是我國大花杓蘭的主要分布區[4]，因此我國的研究以北京百花山、吉林長白山的大花杓蘭為主。對31篇論文的研究內容進一步分析表明，關于大花杓蘭體外人工繁殖的研究最多，約占論文總數的39%；其次是關于大花杓蘭葉片、表皮、胚、珠被、種子、花粉的形態研究，約占論文總數的19%；隨著分子生物學的發展和大花杓蘭研究的不斷深入，關于大花杓蘭的遺傳多樣性、內生真菌多樣性、植物-菌根真菌共生機制等方面的研究也日益廣泛。

3 大花杓蘭的研究進展

大花杓蘭具有重要的觀賞價值、藥用價值、科學研究價值，并具有廣泛的應用潛力。本研究對大花杓蘭的生物學、繁殖生物學、傳粉生物學、菌根共生機理、瀕危機制、保護策略等方面進行論述，以展示近年來大花杓蘭的主要研究成果。

3.1 基礎生物學研究

我國學者對野生花卉、蘭科植物資源、瀕危保護植物資源、觀賞植物資源等進行野外調查時均有提及大花杓蘭，主要涉及其分布、生境、花色、數量、花期、果期等[5-11]。大花杓蘭是我國北方溫帶地生蘭的典型代表物種，主要分布于高山草甸、林下、林間草甸、林緣，因過度采集和生態環境的破壞，野生資源幾近枯竭，成零星狀態分布。大花杓蘭極具觀賞價值，花期為6—7月，通常為粉紫色或紫紅色。經野外調查發現，吉林長白山區天橋嶺的大花杓蘭花色多樣性較高，具有純黃色、純白色、從紅色漸變為白色的多種花色。Sugiura等對日本Ruben島的大花杓蘭進行野外調查時發現，Ruben島大花杓蘭基本為黃白色或白色，紫紅色大花杓蘭非常罕見[12]。

陳麗飛等對長白山地區大花杓蘭的葉片表皮細胞、成熟種子、花粉的微形態進行研究時發現，其葉片表皮細胞形狀不規則，細胞垂周壁呈深波狀，圓形或近圓形氣孔隨機分布于下表皮，葉片表皮有4節柔毛[13]；其種子呈長卵形，種皮表面有淺褐色網狀條紋，網紋多為矩形，網壁邊緣粗糙或光滑[14]；其花粉呈長球形，表面有圓形凹陷，凹陷內部有1個球形內容物，未見明顯萌發孔，花粉外壁有光滑的外壁紋飾[15]。張毓等研究發現，授粉6周后的大花杓蘭種胚發育至球形胚，之后沒有進一步分化，直至種子成熟仍保留球形胚形態，且成熟種子具有內外雙層種皮[16]。由此可見，致密干膜質內種皮可能是大花杓蘭對自然環境的一種保護性適應，也可能是造成其成熟種子萌發困難的主要原因。

3.2 繁殖生物學研究

大花杓蘭具有克隆生長習性，可通過分株進行無性繁殖，但1株大花杓蘭成株每年只能長出為數不多的潛伏芽，繁殖系數較低。此外，長期分株繁殖可能導致品種退化，抗病蟲害能力下降。人工繁殖、栽培、引種馴化等技術可以克服分株無性繁殖的不足，并能在短時間內獲得大量再生植株。

3.2.1 共生萌發及繁殖 國內外學者對大花杓蘭種子-真菌共萌發技術展開研究并取得了一定進展。目前已證實，對大花杓蘭種子共生萌發有促進作用的菌根真菌均屬于瘤菌根菌屬（Epulorhiza）。從C. macranthos var. rebunense成株分離得到的菌根真菌WO97、WO034、WC035促萌發率最高，分別為21.1%、20.9%、24.1%；從幼苗、原球莖分離得到的菌根真菌促萌發率較低，為0.6%～6.6%；從C. macranthos var. speciosum分離得到的菌根真菌也能促進C. macranthos var. rebunense種子萌發，但萌發率較低，僅為1.1%～4.2%；其他蘭科植物的共生真菌Rhizoctonia repens對C. macranthos var. rebunense種子萌發沒有任何促進作用[17]。在不同生長發育階段，宿主植物與其共生真菌對種子的促萌發能力存在明顯差異，并具有種屬特異性。張毓等從吉林長白山野生大花杓蘭的根中分離得到1株瘤菌根菌屬的真菌Cm-J-R-2，并證實該菌株能很好地促進大花杓蘭種子萌發，平均萌發率為29.34%[18]。大花杓蘭與共生真菌之間有很高的專一性，且已證實對大花杓蘭種子有促萌發作用的菌根菌均為瘤菌根菌屬真菌，共生真菌對種子的促萌發率基本穩定在 20%～30%。endprint

3.2.2 非共生無菌萌發及繁殖 非共生無菌萌發是目前蘭花種子人工繁育中最為常用的方式。Miyoshi等研究發現，將NaClO或Ca（ClO）2處理、4 ℃冷處理打破種子休眠、細胞分裂素Kinetin（1 μM）三者有效結合可使大花杓蘭成熟種子的萌發率達到60%～70%[19]。Shimura等成功建立了C. macranthos var. rebunense的微繁殖技術：成熟種子經1%NaClO消毒30～60 min后播種于含有1 μmol/L NAA和BA的培養基中；4 ℃冷處理3個月以解除種子休眠；轉至20 ℃繼續培養，直至種子萌發形成類原球莖的愈傷組織；每個直徑為5 mm的類原球莖每年可再生約10株幼苗；幼苗經低溫馴化（10 ℃ 1個月，4 ℃ 2個月）后移栽到花盆中（栽培基質為粗火山灰和黏土），約80%幼苗能較好地發育并長出新葉子[20]。Taniguchi等研究發現，C. macranthos var. rebunense未成熟種子萌發的最適培養基為T培養基或MS培養基[21]。適宜的人工培養條件（溫度、濕度、培養成分、光照），加上種子和幼苗數次4 ℃冷處理，使人工繁殖的C. macranthos var.rebunense第1朵花在溫室里盛開，從種子萌發到開花歷時7年。王艷麗等以移栽2年的野生大花杓蘭未開裂的黃綠色蒴果種子進行組織培養與快速繁殖，種子在Harvais、VWD培養基上萌發形成白色原球莖，原球莖分化誘導出芽、根后，選擇高度 1.5 cm 以上、根系發達、長勢良好的幼苗移入移栽基質（珍珠巖、蛭石、草炭灰、樹葉的比例為1 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 1）中，精心呵護1個月后幼苗成活率達70%以上[22]，但種子萌發率、原球莖誘導分化率、幼苗生長率、是否開花結實均未提及。張毓等研究發現，大花杓蘭未成熟綠莢種子（種胚發育形成球形胚，但內種皮未形成干膜前）在VW改良培養基（2.0 mg/L 6-BA）上培養，萌發率高達60.54%[23]。鄧蓮等研究發現，大花杓蘭（北京百花山）授粉后6～8周，種子萌發率明顯高于幼嫩或成熟種子；在VWD改良培養基上培養，種子萌發率高達68%；1.2 mg/L KT是既能促進大花杓蘭種子萌發，又能維持原球莖低褐化率的適宜激素濃度；有機添加物（如100 mL/L椰乳或馬鈴薯）有利于大花杓蘭種子的萌發[24]。樸仁哲等對吉林長白山移栽2年的野生大花杓蘭進行人工輔助授粉，并以授粉13周后的半成熟種子為試驗材料，從種子處理、培養基、生長激素等方面探討大花杓蘭無菌萌發。研究結果表明，經0.5%NaClO處理160 min的種子萌發率最高，可達68%以上；最適培養基為Harvais培養基，最適pH值為5.5～5.8；6-BA對種子的促進萌發效果明顯優于KT；添加馬鈴薯、蘋果均可促進大花杓蘭種子的無菌萌發，但馬鈴薯的促萌發效果更為明顯[25]。

NaClO濃度、作用時間、低溫預處理、培養基、培養溫度、激素、有機添加物對大花杓蘭種子的無菌萌發均有一定影響，但低溫預處理、有機添加物并非無菌萌發所必需的。成熟種子和未成熟種子均可在實驗室條件下進行無菌萌發，且萌發率高達60%左右，明顯高于萌發率僅為20%～30%的共生萌發。種子的無菌萌發也有一定局限性，未成熟的種子不耐儲存，采摘后須立即試驗，1年只有1次試驗機會，且未成熟種子的最佳采摘時期不易把握。

3.3 傳粉生物學研究

Sugiura等對日本Ruben島分布的大花杓蘭進行野外資源調查時發現，熊蜂的蜂王是大花杓蘭唯一的傳粉者，同時也是馬先蒿（Pedicularis schistostegia）的傳粉者；大花杓蘭與馬先蒿花色相同，且花期重疊，在野外生境混生，但大花杓蘭出現的頻率相對較低；覓食的熊蜂有時會混淆大花杓蘭和馬先蒿；大花杓蘭和馬先蒿在空間分布上有很大程度的重疊，臨近2個植物的植株高度基本一致；大花杓蘭和馬先蒿的淡黃色、白色花朵恰在大黃蜂的可見光譜范圍內[12，26]。上述研究發現表明，C. macranthos var. rebunense通過擬態伴生植物馬先蒿來引誘熊蜂傳粉，其傳粉機制完全不同于杓蘭[27]（Cypripedium calceolus）等杓蘭屬的其他種類，這可能是適應環境變化的一種進化機制。

3.4 菌根共生機理

菌根真菌與蘭科植物的關系十分密切，蘭科植物的種子萌發、幼苗生長、植株形成都離不開菌根真菌。在自然條件下，大花杓蘭種子不易萌發，需依賴真菌的侵染并與其建立共生關系，才能促進種子的萌發。目前，大花杓蘭與菌根菌的共生機制尚不明確，似乎與其他陸生植物和菌根菌之間的互惠共生關系不同，而是生與死（life-and-death）的斗爭關系[28]。Shimura等從大花杓蘭幼苗中分離鑒定了2種抗菌活性物質lusianthrin和chrysin，并證實lusianthrin在大花杓蘭種子與真菌共生萌發過程中起著重要作用，而chrysin作為植物抗毒素保護大花杓蘭免受病原菌侵害[28]。開花成株的大花杓蘭菌根真菌分離率明顯高于其幼苗和原球莖，且成株分離到的菌根真菌更能有效促進種子萌發[17]。張亞平對吉林地區大花杓蘭不同生長發育階段的內生真菌分布進行調查，發現開花植株在萌芽期、展葉期的內生真菌分離率分別為34.52%、55.95%，而開花期內生真菌分離率僅為4.00%左右[29]?？赡苁巧成系牟町愒斐闪舜蠡ㄨ继m不同的共生營養模式，從而造成二者結果的差異。張亞平首次報道，分離鑒定的3株雞油菌目（Cantharellales）內生真菌均能極顯著提高原球莖的花芽分化率，并能降低褐化死亡率，促進大花杓蘭原球莖的生長和發育。在整個生命周期中，大花杓蘭可能與不同真菌建立共生關系并產生多種抗菌活性物質，有些抗菌活性物質將參與大花杓蘭種子與真菌的共生萌發。上述研究結果為大花杓蘭菌根共生的分子機理研究奠定了基礎。

3.5 瀕危機制及保育策略endprint

大花杓蘭的野生種群逐漸衰退，數量急劇減少，處于瀕危狀態。大花杓蘭瀕危的主要原因并非其對現有自然環境的不適應，而是人類活動導致的生態環境破壞以及非法濫采亂挖所致[30]。林大影通過對北京瀕危植物的分布及其生存群落特征的研究，計算出大花杓蘭的生態位寬度為0.024，表明適于其生存的生境較少，急需優先保護[31]。為更好地保護、研究、開發利用大花杓蘭植物資源，國內外學者對其開展了人工繁殖、引種馴化及相關的基礎性研究，并提出一些保育策略：加強植物生境的保護；制定和完善相關法律法規，加強宣傳教育，提高社會公眾保護生物多樣性的自覺意識；建立植物資源數據庫，開展就地保護和監測；注重科研院所與高校合作研究，加強科研攻關，進行大花杓蘭植物傳粉、種子擴散等機理研究，從而提供合理的保護措施；遷地保護或離體保護；人工輔助進行種子原位就地播種[8，10，32-34]。

3.6 其他方面

隨著分子生物學技術的發展，大花杓蘭的研究領域得以不斷拓展。Izawa等應用等位酶標記技術對日本Ruben島分布的大花杓蘭野生種群進行遺傳多樣性研究，發現C. macranthos var.rebunense比其他植物類群具有更高的遺傳多樣性[34]。蔣明等克隆并分析了10種杓蘭屬植物的ITS序列，序列長度為522～572 bp，變異位點十分豐富，其中高山杓蘭和大花杓蘭的ITS片段缺失現象尤為明顯[35]。2014年，大花杓蘭葉綠體基因組（登錄號：KF92543）的測序工作已完成，豐富了蘭科植物葉綠體基因組的多樣性[36]。這些研究結果為蘭科植物遺傳多樣性、分子系統發育的研究奠定了理論基礎，對制定合理的大花杓蘭保護策略具有指導意義。另外，秦瑀研究證實了大花杓蘭的水提醇液具有利尿作用[37]，但其藥用化學成分的分離純化與結構鑒定有待進一步深入研究。

4 展望

目前，國內外學者對大花杓蘭人工繁殖及其應用的研究已取得一定進展，但由于其褐化率死亡率高、幼苗生長緩慢等研究瓶頸尚未突破，致使大花杓蘭人工繁殖至今仍處于少量微繁殖階段。大花杓蘭是珍稀瀕危國家重點保護野生植物，其研究材料的相對匱乏導致國內外對大花杓蘭內生菌多樣性、菌根真菌的生理生化特性，尤其是大花杓蘭-菌根真菌共生分子機理的認識十分有限，一定程度上限制了大花杓蘭菌根化應用技術的發展。近年來，隨著分子生物學技術的發展，ITS和DNA條形碼技術等已被應用于大花杓蘭遺傳多樣性的研究中[38]，為今后大花杓蘭的原地或遷地保育提供理論基礎。

從國內外發表的大花杓蘭期刊論文來看，大花杓蘭的研究起步較晚且發展緩慢，很多領域有待進一步深入研究。鑒于我國大花杓蘭的研究現狀、應用價值、開發利用前景，對我國未來大花杓蘭的研究提出如下建議：全面開展大花杓蘭植物資源的現狀調查，系統了解其分布、生境、數量、生長及繁殖狀況，深入開展生態學、居群生物學等基礎性研究，為制定合理、有針對性的保育策略提供理論基礎。應用mRNA差異顯示技術、RT-PCR、RACE方法等強有力的技術手段，篩選參與共生萌發的關鍵候選基因，為深入研究大花杓蘭植物菌根共生的分子機理提供科學線索。建立優良菌株的篩選、培養、評價體系，篩選能有效促進大花杓蘭植物種子萌發、原球莖分化、幼苗生長發育的菌根真菌，為應用菌根共生技術實現大花杓蘭植物資源的保護和規?；敝车於ɑA。結合DNA條形碼技術、野外生態學開展人工繁殖大花杓蘭“回歸自然”的相關研究，這是緩解大花杓蘭瀕危程度、恢復其野生種群最為直接有效的技術手段，也是深入開展其他研究工作的重要基礎。

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