3-取代吲哚-2-酮類化合物的設計、合成及抗腫瘤活性研究

·論著·

3-取代吲哚-2-酮類化合物的設計、合成及抗腫瘤活性研究

周浩，周峰，周有駿(第二軍醫大學藥學院藥物化學教研室，上海 200433)

[摘要]目的設計合成對微管蛋白和血管內皮細胞生長因子受體2(VEGFR-2)激酶具有雙重抑制作用的3-取代吲哚-2-酮類化合物,考察其體外抑瘤活性。方法以取代的苯胺為起始原料，經縮合、環合、還原、取代等反應制得系列目標化合物，并考察該系列化合物對微管蛋白和腫瘤細胞的抑制活性。結果共合成了11個新的目標化合物。實驗結果顯示，化合物j9對微管蛋白和VEGFR-2激酶具有雙重抑制活性。所有目標化合物對3種腫瘤細胞株均有中等強度的抑制活性。結論該類化合物是一類具有多靶點作用的抗腫瘤化合物。

[關鍵詞]血管靶向藥物；3-取代吲哚-2-酮類化合物；微管蛋白抑制活性；激酶抑制活性

[基金項目]國家自然科學基金(21172260)

[作者簡介]周浩,碩士研究生.Tel:15001753465；E-mail:zhouhaoin2008@126.com

[通訊作者]周有駿，教授，博士生導師.研究方向：抗腫瘤藥物的設計與合成.Tel:(021)81871231; E-mail:zhouyoujun2005@aliyun.com

[中圖分類號]R916.1[文獻標志碼]A

DOI[]10.3969/j.issn.1006-0111.2015.02.010

[收稿日期]2014-11-03[修回日期]2015-01-20

Design, synthesis and anti-tumor activitiesinvitroof novel 3-substituted indolin-2-one compounds

ZHOU Hao，ZHOU Feng，ZHOU Youjun(Department of Medical Chemistry, School of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)

Abstract[]ObjectiveTo compose and evaluate anti-tumor activities of 3-substituted indole-2-one compounds which may have dual inhibitory activities against both tubulin protein and VEGFR-2 tyrosine kinase. MethodsTarget compounds were prepared starting from substituted aniline via condensation, cyclization and reduction. Results11 target compounds were synthesized and all the compounds displayed moderate anti-proliferative activities against three tumor cell lines. Compound j9 showed a certain inhibitory activity against both VEGFR-2 kinase and tubulin protein in vitro. ConclusionThis series of indolin-2-one derivatives were found to be a novel kind of multi-target inhibitor.

[Key words]vascular targeting drug; 3-substituted indolin-2-one compounds; tubulin inhibitory activities; kinase inhibitory activities

腫瘤是一種全球性的常見病、多發病，嚴重威脅人類的生命健康和生活質量。近年來，由于人們不良的生活習慣及生存環境的惡化，使得腫瘤的發病率呈逐年上升趨勢。因此，合理的腫瘤治療手段顯得格外重要。

自從1971年Folkman[1]首次提出腫瘤新生血管對腫瘤的生長及擴散起重要作用以來，腫瘤血管靶向治療受到了高度重視。腫瘤血管靶向治療與傳統的抗腫瘤藥物相比，具有選擇性高、毒性小，抗瘤譜廣等優點，這些優勢使得腫瘤血管靶向藥物發展十分迅速，并成為一種有效的腫瘤治療手段[2,3]。

3-取代吲哚-2-酮類化合物是一類通過抑制酪氨酸激酶受體(RTKs)而發揮作用的腫瘤血管靶向藥物，如SU5416是由Sugen公司研發的一種靶向血管內皮細胞生長因子受體2(VEGFR-2)酪氨酸激酶抑制劑[4]。SU5416衍生物Sunitinib maleate(商品名：Sutent，由Pfizer開發) 在2006年1月獲得FDA批準上市，用于治療胃腸基質細胞癌和進展期腎細胞癌[5]。

反式-3,5,4′-三甲氧基白藜蘆醇(TMS)，是由意大利布雷西亞大學生物醫學與技術學院等單位研制開發的反式白藜蘆醇三甲基化衍生物(圖1)。研究表明，TMS可以影響鼠科主動脈血管內皮細胞(MAE)中微管蛋白的聚合作用，干擾其微管聚合中心的形成。1.0 μmol/L濃度的TMS能明顯降低MAE細胞中微管蛋白的聚合，從而發揮血管阻斷作用[6]。

分析SU5416和TMS的結構，以SU5416和TMS為先導化合物，以各種取代芳環置換SU5416中的吡咯環，設計并合成具有兩者相似骨架并對酪氨酸激酶受體和微管蛋白具有雙重抑制活性的新型腫瘤血管化合物。

目標化合物以取代苯胺為起始原料，經縮合、環合、還原、取代等四步反應制得。目標化合物結構和合成路線見圖2。

圖1　SU5416、Sutent和TMS的結構式

圖2　目標化合物結構及合成路線 反應條件：(a) 水合三氯乙醛, 十水合硫酸鈉，鹽酸羥胺，濃鹽酸，回流，2 h；(b)濃硫酸，80～90 ℃，20 min； (c)三氟乙酸，三乙基硅烷，室溫，4 h；(d)取代苯甲醛，哌啶，乙酸，乙酸乙酯，室溫，8～48 h

1實驗部分

1.1儀器及材料85-1型磁力攪拌器(上海志威電器有限公司)；ZD267型機械攪拌器(北京京偉欣業電器有限公司)；KE-20-5型旋轉蒸發儀(上海予華儀器設備有限公司)；SHB-Ⅲ型循環水式多用真空泵(鞏義市英峪華科儀器廠)；RY-2熔點儀(天津市分析儀器廠，溫度計經校正)；Bruker AC-300P型核磁共振氫譜(溶劑為DMSO,300 MHz)；Varian-1200L型質譜儀；合成過程中所用原料及試劑均為市售分析純。

1.2目標化合物的合成

1.2.12-(肟基)-N-苯乙酰胺類化合物(g)的合成向反應瓶中加入水合三氯乙醛(44.5 g,0.27 mol)和水(1 L)，攪拌溶解后，分別加入十水合硫酸鈉(650 g，2.02 mol)、取代苯胺(0.25 mol)、鹽酸羥胺(54.2 g，0.78 mol)和濃鹽酸(21 ml)。劇烈攪拌下，加熱回流25 min，然后于室溫下冷卻攪拌2 h，過濾，烘干，得褐色固體(g)，收率86.2%～94.6%。

1.2.2二氫吲哚-2,3-二酮類化合物(h)的合成向反應瓶中加入濃硫酸(120 ml)，于50℃下保溫，分批加入化合物(g)0.20 mol，控制內溫80～90℃。加完溶液后保溫20 min，倒入冰水(250 ml)中，攪拌1 h，用乙酸乙酯(150 ml×3)提取，合并有機相，無水硫酸鈉干燥，濃縮后得褐色粗品。用乙酸(80 ml)重結晶，得棕黃色固體(h)，收率71.4%～83.1%。

1.2.3吲哚-2-酮類化合物(i)的合成氮氣保護下，向反應瓶中分別加入(h)10 mmol、三氟乙酸10 ml和三乙基硅烷(3.48 g，30 mmol)，于25 ℃攪拌4 h。將反應液減壓濃縮后，加入乙醚(5 ml)，攪拌0.5 h,過濾，洗滌，烘干，得類白色固體(i)，收率89.6%～97.3%。

1.2.43-苯亞甲基吲哚-2-酮類化合物(j)的合成向100 ml反應瓶中加入化合物(i)2 mmol、取代苯甲醛(2.4 mmol)、哌啶(0.1 mmol)、乙酸(0.1 mmol)、分子篩(10 g)和乙酸乙酯(50 ml)。室溫下攪拌反應8～48 h，硅藻土過濾，得橙黃色至淺棕色清液。減壓濃縮后，得粗品，硅膠柱層析，以PE-EA體系洗脫，得系列化合物j1～j11，收率27.3%～84.6%。

1.2.5目標化合物(j9)的單晶培養 將j9溶解于二氯甲烷和乙酸乙酯的混合溶劑中，然后靜置慢慢揮發溶劑3～5 d，等至母液中析出橘紅色長方形晶體，過濾后干燥。

1.3結果與討論共合成了11個目標化合物。所有目標化合物均未見文獻報道。目標化合物的化學結構、熔點及光譜數據見表1。實驗采用單晶X-衍射測定化合物j9的構型。結果顯示其為Z構型(圖3、圖4)，與先導化合物的構型相一致。

表1目標化合物的化學結構、熔點及光譜數據

編號R1R2熔點(℃)質譜核磁共振光譜(化學位移值)j15-OH,6-OMeH249～251268.2(M+H)+1HNMR(300MHz,DMSO)δ:10.24(s,1H),8.55(s,1H),7.64(d,J=6.7Hz,2H),7.56～7.42(m,3H),7.38(s,1H),7.06(s,1H),6.44(s,1H),3.77(s,3H)j25-OH,6-OMe3',5'-OMe244～246328.3(M+H)+1HNMR(300MHz,DMSO)δ:10.23(s,1H),8.62(s,1H),7.31(s,1H),7.14(s,1H),6.78(d,J=2.2Hz,2H),6.56(t,J=2.2Hz,1H),6.43(s,1H),3.88～3.66(m,9H)j35-OH,6-OMe4'-CMe3198～200324.2(M+H)+1HNMR(300MHz,DMSO)δ:10.22(s,1H),8.56(d,J=1.7Hz,1H),7.56(dd,J=24.7,8.4Hz,4H),7.35(s,1H),7.16(s,1H),6.44(s,1H),3.77(s,3H),1.32(d,J=1.6Hz,9H)j45-OH,6-OMe4'-NO2>250313.1(M+H)+1HNMR(300MHz,DMSO)δ:10.42(s,1H),8.67(s,1H),7.96～7.81(m,4H),7.48(s,1H),6.96(s,1H),6.46(s,1H),3.81(s,3H)j55-OH,6-OMe4'-CF3244～246336.3(M+H)+1HNMR(300MHz,DMSO)δ:10.31(s,1H),8.63(s,1H),7.94～7.76(m,4H),7.40(s,1H),6.95(s,1H),6.45(s,1H),3.77(s,3H)j65-OH,6-OMe4'-Br>250346.1(M+H)+1HNMR(300MHz,DMSO)δ:10.26(s,1H),8.60(s,1H),7.69(d,J=7.9Hz,2H),7.58(d,J=8.1Hz,2H),7.31(s,1H),7.00(s,1H),6.43(s,1H),3.76(s,3H)j74,5,6-OMe3'-NO2241～244357.2(M+H)+1HNMR(300MHz,DMSO)δ:10.59(s,1H),9.16(s,1H),8.45～8.26(m,1H),8.21(dd,J=7.9,1.9Hz,1H),7.90(s,1H),7.68(t,J=8.0Hz,1H),6.28(s,1H),4.00(d,J=8.5Hz,3H),3.82(s,3H),3.70(s,3H)j84,5,6-OMe4'-Br176～178390.2(M+H)+1HNMR(300MHz,DMSO)δ:10.54(s,1H),8.09(d,J=8.6Hz,2H),7.79(s,1H),7.60(d,J=8.6Hz,2H),6.26(s,1H),3.95(s,3H),3.80(s,3H),3.69(s,3H)j94,5,6-OMe3'-OH,4'-OMe184～186358.2(M+H)+1HNMR(600MHz,DMSO)δ:10.40(s,1H),9.03(s,1H),7.98(d,J=2.1Hz,1H),7.77(s,1H),7.62(dd,J=8.6,2.1Hz,1H),6.96(d,J=8.5Hz,1H),6.26(s,1H),3.92(s,3H),3.82(s,3H),3.79(s,3H),3.69(s,3H)j104,5,6-OMe4'-CMe3168～170368.1(M+H)+1HNMR(300MHz,DMSO)δ:10.49(s,1H),8.11(d,J=8.4Hz,2H),7.84(s,1H),7.43(d,J=8.5Hz,2H),6.26(s,1H),3.93(s,3H),3.80(s,3H),3.69(s,3H),1.30(s,9H)j114,5,6-OMe3'-OH206～208328.4(M+H)+1HNMR(300MHz,DMSO)δ:10.48(s,1H),9.48(s,1H),7.79(s,1H),7.70(s,1H),7.49(d,J=7.8Hz,1H),7.20(t,J=7.9Hz,1H),6.80(dd,J=8.1,1.2Hz,1H),6.26(s,1H),3.94(d,J=1.1Hz,3H),3.80(s,3H),3.69(s,3H)

圖3　j9的單晶衍射分子圖

圖4　j9的晶胞圖

2生物活性研究

2.1體外抑瘤活性實驗參考四氮唑鹽還原法(MTT法)[7,8]測定樣品對MDA-MB-435、HCT116、CEM細胞株的作用強度。測試結果見表2。

2.2體外微管蛋白抑制活性實驗采用文獻[9]方法和微管蛋白試劑盒方法(cyto-dynamix screen 03), 以CA4為對照藥品，測定化合物j9對微管蛋白的抑制活性，兩者濃度均為10 μmol/L，

j9的抑制

率為47.1%，CA4抑制率為92.4%。

表2　目標化合物的腫瘤抑制活性(IC 50,μmol/L)

2.3體外VEGFR-2激酶抑制活性實驗采用酶聯免疫吸附法 (enzyme-linked immunesorbent assay, ELISA)，以Su11248為對照藥品，在490 nm波長下使用酶標儀(molecular devices spectramax 190)測得樣品的吸光度A490值。j9與Su11248的濃度均為10 μmol/L，抑制率分別為42.9%和84.9%。

2.4結果與討論體外抑瘤活性結果顯示，所有目標化合物對3種腫瘤細胞均具有中等強度的抑制活性。其中化合物j10對HCT116的抑制活性最強，IC50達6.3 μmol/L?；衔飆9的生物活性研究顯示，該化合物對微管蛋白和VEGFR-2均具有中等強度的抑制活性。

實驗結果表明，本研究設計合成的新型3-取代吲哚-2-酮類化合物是一類對微管蛋白和VEGFR-2激酶具有雙重抑制活性的抗腫瘤化合物。本研究為深入開展多靶點作用抗腫瘤化合物的設計打下了一定的研究基礎，也為微管蛋白和VEGFR-2激酶雙重抑制劑提供了新的結構類型。

【參考文獻】

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[本文編輯]顧文華