正交試驗優選元寶草中總黃酮的提取工藝

·論著·

正交試驗優選元寶草中總黃酮的提取工藝

龔穎珍1,2,鄭承劍2,秦路平2(1. 福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350108;2. 第二軍醫大學藥學院生藥學教研室，上海 200433)

[摘要]目的優選元寶草中總黃酮的提取工藝。方法在單因素試驗的基礎上，考察乙醇濃度、料液比、提取溫度等因素對元寶草中總黃酮提取率的影響，并采用L9(3)4正交試驗優選最佳提取條件。結果影響元寶草中總黃酮提取率的因素順序為乙醇濃度>料液比>提取次數>提取溫度。元寶草最佳提取工藝條件為70%乙醇，提取溫度60 ℃，乙醇用量20倍，提取次數3次。該條件下元寶草中總黃酮平均得率為2.38%。結論本實驗設計合理、測定方法可行、實驗結果可靠，為大批量從元寶草中提取總黃酮提供了理論依據。

[關鍵詞]元寶草；總黃酮；提取工藝；正交試驗

[基金項目]上海市科委中藥現代化專項 (2011DZ1970502)

[作者簡介]龔穎珍，碩士研究生. Tel: 13611886074；E-mail:gyz0929@163.com

[通訊作者]秦路平，教授.研究方向：生藥活性物質基礎及其品質評價研究.Tel:(021)81871300；E-mail:qinsmmu@126.com

[中圖分類號]R93[文獻標志碼]A

DOI[]10.3969/j.issn.1006-0111.2015.02.011

[收稿日期]2013-10-17[修回日期]2014-03-17

Extraction process on total falvonoids fromHypericumsampsoniiby orthogonal experiments

GONG Yingzhen1,2, ZHENG Chengjian2, QIN Luping2(1. School of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350108, China；2. Department of Pharmacognosy, School of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)

Abstract[]ObjectiveTo optimize the extraction technology of total falvonoids from Hypericum sampsonii.MethodsOn the basis of single factor test, solid-liquid ratio, ethanol concentration, extraction time, extraction temperature and extraction times on the extraction rate were studied by taking the content of total falvonoids as indexes. Orthogonal test was conducted to establish the extraction technology of total falvonoids from Hypericum sampsonii.ResultsThe influence degree of factors on the extraction rate of total falvonoids was in the order of ethanol concentration, solid-liquid ratio, extraction times, and temperature.The optimum extraction condition was confirmed as follows: ethanol concentration of 70%, extraction temperature of 60 ℃, and extraction times of 3×1.5 h, solid to liquid ratio of 1:20. Under this condition，the average extraction rate of total falvonoids reached 2.38%.ConclusionThe test was reasonable in design and credible in findings, and was easily operated, which could provide scientific basis for the batch extraction of total flavonoids from Hypericum sampsonii.

[Key words]Hypericumsampsonii；total flavonoids；extracting technology；orthogonal test

元寶草(HypericumsampsoniiHance)系藤黃科金絲桃屬多年生草本植物，全草入藥，廣泛分布于我國長江流域以南各省區[1]。

近年來研究結果表明,元寶草黃酮類成分是其主要的抗抑郁活性成分之一[2]。研究者從元寶草中分離出很多黃酮類成分，其中以芒果苷為代表的呫酮類成分較多[3]。本課題組前期還從元寶草中分離出一些新的呫酮，如hypericumxanthone A[4]和sampsone C[5]等,呫酮類化合物經研究表明也具有抗抑郁活性[6]。文獻[7]曾以蘆丁為對照品，對元寶草總黃酮的提取工藝進行研究。而多數研究表明芒果苷在元寶草中含量較高[8，9]，筆者認為以芒果苷作為對照品進行元寶草總黃酮提取工藝考察較為合理。因此，本實驗以芒果苷作為對照品，考察了元寶草全草中總黃酮的提取工藝。

本實驗以總黃酮提取率為考察指標，優選元寶草中總黃酮的最佳提取工藝條件，進一步明確了元寶草中總黃酮是否具有抗抑郁活性。

1材料與儀器

1.1材料芒果苷對照品購自上海詩丹德生物技術公司，批號：05/090507, 純度99%；元寶草全草于2012年8月購自安徽亳州，經第二軍醫大學藥學院生藥學教研室秦路平教授鑒定為金絲桃科多年生草本植物元寶草(HypericumsampsoniiHance)，選用部位為全草；NaNO2、Al(NO)3、NaOH、乙醇、甲醇均為分析純。

1.2儀器UV5500紫外分光光度儀，旋轉蒸發儀(RE-52C，上海清浦瀘西儀器廠)，超聲儀(USC-702，上海波龍電子設備有限公司)，粉碎機(DFY-500，上海鼎廣機械有限公司)。

2方法與結果

2.1總黃酮含量的測定

2.1.1對照品溶液的制備精密稱取芒果苷對照品5 mg于25 ml容量瓶中，甲醇定容，搖勻，配成0.2 mg/ml的對照品溶液。

2.1.2標準曲線的繪制精密吸取對照品溶液0、0.125、0.25、0.5、0.75、1.0、1.2、1.5 ml，分別置于10 ml容量瓶中，分別加入5% NaNO2溶液0.3 ml，搖勻，放置6 min后各加入10% Al(NO3)3溶液0.3 ml，搖勻，放置6 min，再分別加入10% NaOH溶液4.0 ml，再加甲醇至刻度，搖勻，放置15 min，在366 nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，標準回歸曲線方程Y=35.288X-0.194 1，r=0.999 2。

2.1.3波長的選擇取芒果苷標準溶液1.0 ml，按標準曲線項下操作，用UV5500紫外分光光度計進行測定，芒果苷反應產物在366、316、258 nm處有最大吸收，因316、258 nm處干擾大，因此，選擇366 nm為測定波長。

2.1.4供試品溶液的制備稱取5 g干燥、粉碎的元寶草全草，加入70%乙醇50 ml回流1.5 h，將提取液抽濾，濾渣在相同條件下提取1次，合并濾液定容至250 ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，稀釋50倍，按標準曲線項下操作，測定吸光度。芒果苷提取率(%)=(C×N×V/W) ×100，式中C為測定樣品溶液中芒果苷的濃度，N為稀釋倍數，V為最初樣品定容體積，W為樣品質量。

2.2方法學考察

2.2.1精密度實驗取同一份供試品溶液，按標準曲線項下操作，重復測定5次，求得RSD=1.4%。

2.2.2穩定性實驗取同一份供試品溶液，同上操作，于1、2、3、5、6 h測定吸收度，求得RSD=1.2%。

2.2.3重復性實驗取同一批次元寶草藥材樣品，平行制備5份供試品溶液，同上操作，結果RSD=1.7%。

2.2.4加樣回收率實驗精密量取2 ml已測定總黃酮含量(C=0.199 53 mg/ml)的樣品液9份，各分別加入芒果苷對照品溶液(0.2 g/ml)1、1、1、2、2、2、3、3、3 ml，同上操作，平均回收率為94.56%，計算RSD=2.3%。

表1　回收率實驗結果( n=9)

2.3總黃酮提取工藝單因素試驗

2.3.1乙醇濃度10倍量、50 ℃下提取2次，每次1 h，考察30%、40%、60%、80%、95%乙醇濃度，樣品中總黃酮的提取率。結果顯示，隨著乙醇濃度的增加，元寶草中總黃酮的提取率先增加后降低，在80%乙醇濃度時總黃酮提取率達到最大值。

2.3.2提取時間10倍量80%乙醇，50 ℃下提取2次，考察提取時間0.5、1、1.5、2、2.5 h時樣品中總黃酮的提取率。結果表明，隨著提取時間的增加，樣品中總黃酮的提取率逐漸增加，當提取時間增加到1.5 h后，總黃酮的提取率趨于平穩。

2.3.3料液比80%乙醇在50 ℃下提取2次，每次1.5 h，考察料液比1:5，1:10，1:15，1:20，1:25時樣品中總黃酮的提取率。結果表明，當料液比為1:5時，溶劑用量過小，總黃酮提取率較低；當料液比為1:15時，總黃酮提取率最高，繼續增加料液比，總黃酮提取率反而降低。

2.3.4提取溫度10倍量80%乙醇，提取2次，每次1.5 h，考察提取溫度40、50、60、70、80 ℃時樣品中總黃酮的提取率。結果表明，溫度70 ℃時，提取率最高，當溫度升高，提取率趨于平穩。

2.3.5提取次數10倍量80%乙醇，50 ℃、每次1.5 h考察提取1次、2次、3次、4次時樣品中總黃酮的提取率。結果表明，提取次數為2次時總黃酮提取率達到最大值，3次時平衡，隨著提取次數增加，提取率稍有減少。

2.4正交試驗優選總黃酮的提取工藝在單因素試驗基礎上，選擇4個影響較顯著的因素：乙醇濃度、料液比、提取次數、提取溫度，以總黃酮的提取率(%)為考擦指標，按照L9(34)正交試驗表進行試驗，確定元寶草中總黃酮的最佳提取工藝。

表2　正交試驗因素水平

表3　正交試驗設計與結果

表4　SPSS方差分析表

F0.05(2,2)=19.0，1)R2=0.806(調整R2=0.720)

由表3中極差R值大小顯示，各因素作用主次為：A>C>D>B，即乙醇濃度影響最大，其次是料液比和提取次數，提取溫度影響最小。從表4的方差分析結果可以看出，乙醇濃度與料液比對總黃酮的提取率有較大影響(PA=2.24×10-5<0.05，PC=3.80×10-4<0.05)，而提取溫度與提取次數對總黃酮的提取率影響較小(PB=0.447>0.05，PD=0.056>0.05)。因此，以A1B1C3D3為最佳提取工藝，即70%乙醇，提取溫度60 ℃，乙醇用量20倍，提取次數3次。

2.5最佳提取工藝驗證按最佳提取工藝條件A1B1C3D3組合進行試驗，平行提取3次，總黃酮的提取率分別為2.41%、2.35%、2.38%,提取率均值為2.38%，且高于正交試驗中的最高值，表明該優化條件穩定有效。

3討論

本實驗中曾采用超聲、乙醇熱回流、水進行提取，相比較而言，超聲的提取效果好，但超聲不易用于大批量工業化生產，水對黃酮的溶解度小，故本實驗采用乙醇提取,具有實用性。

元寶草中黃酮類成分較多[3]，例如蘆丁、2-hydroxyxanthone、芒果苷、hyperxanthone等。若采用高效液相色譜法來檢測總黃酮成分，因標準品較多，不易購買，需通過分離化合物得到其他的標準品，比紫外分析法復雜；且若采用一測多評，因其相對校正因子有波動，實測值與計算值之間有誤差，主要問題是由于只有內參物用到了對照品，其他待測成分無對照品，通過液-質聯用等輔助才可確認，有些目標峰還不確定，相比較而言成本高、方法復雜。最終決定采用NaNO2-Al(NO)3-NaOH法來檢測元寶草中的總黃酮。文獻[7]元寶草總黃酮的提取工藝是以蘆丁為對照品，在500 nm波長處測其吸收度，由于呫酮類成分占元寶草總黃酮的比例大[3]，以芒果苷作為對照品能更好地檢測元寶草中黃酮的含量，也為元寶草呫酮類成分的含量測定提供參考,本課題主要考察芒果苷和總黃酮的抗抑郁活性，則以芒果苷作對照品更有意義。

近年來研究表明，元寶草具有抗抑郁活性[10]，并可分離出較多的呫酮類成分，且現代藥理學研究表明呫酮類成分也具有抗抑郁活性[6]，如芒果苷亦具有良好的抗抑郁作用[11]，這些研究結果加強了元寶草總黃酮具有抗抑郁作用的依據。本課題以芒果苷作為對照品，通過單因素和正交試驗研究各因素對元寶草中總黃酮提取率的影響，篩選出總黃酮的最佳提取工藝，為大批量從元寶草中提取總黃酮提供理論依據，為以后進一步研究黃酮類成分抗抑郁活性提供參考。

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[本文編輯]李睿旻