大蒜素對空腸彎曲桿菌抑菌作用的研究

·論著·

大蒜素對空腸彎曲桿菌抑菌作用的研究

潘洪濤1，楊宗興1，趙文萃1，王艷萍1，宋海艷1,2，張琦1(1.解放軍208醫院，吉林 長春 130062； 2.延邊大學藥學院，吉林 延吉 133000)

[摘要]目的 研究大蒜素對空腸彎曲桿菌的抑菌作用和強度。方法 采用紙片擴散法(K-B法)測定抑菌圈直徑；采用肉湯稀釋法分別測定大蒜素、環丙沙星、紅霉素對空腸彎曲桿菌的最低抑菌濃度(MIC)，比較大蒜素、環丙沙星、紅霉素的最低抑菌濃度及抑菌率。結果 大蒜素(MIC為12.80 μg/ml，抑菌率90.40%)對空腸彎曲桿菌的抑菌作用較環丙沙星(MIC為20.48 μg/ml，抑菌率90.21%)和紅霉素(MIC為35.84 μg/ml，抑菌率90.33%)更強。結論大蒜素對空腸彎曲桿菌具有抑菌作用。

[關鍵詞]大蒜素；環丙沙星；紅霉素；最低抑菌濃度；抑菌率

[作者簡介]潘洪濤，副主任技師.Tel:15304451257；E-mail:pta208@163.com

[通訊作者]趙文萃，副主任藥師.研究方向：藥劑學.Tel:(0431)86988148；E-mail:zhaowencui208@126.com

[中圖分類號]R96[文獻標志碼]A

DOI[]10.3969/j.issn.1006-0111.2015.02.014

[收稿日期]2014-03-03[修回日期]2014-09-24

Study on anti-microbial activity of allicin oncampylobacterjejuni

PAN Hongtao1, YANG Zongxing1,ZHAO Wencui1,WANG Yanping1,SONG Haiyan1，2,ZHANG Qi1(1.Department of Pharmacy, No.208 Hospital of PLA, Changchun 130062, China； 2.College of Pharmacy,Yanbian University, Yanji 133000, China)

Abstract[]ObjectiveTo study the anti-microbial activity and strength of allicin on Campylobacter jejuni.MethodsDisc diffusion method (K-B) was used to determine the diameter of the bacteriostatic ring. The minimal inhibitory concentration (MIC) of allicin, ciprofloxacin and erythromycin were detected by constant broth dilution method, respectively.The minimal inhibitory concentrations and bacteriostatic rate of allicin,ciprofloxacin and erythromycin were compared.ResultsThe anti-microbial activity on Campylobacter jejuni of allicin (MIC 12.8 μg/ml, bactetiostatic rate 90.40%) was better than that of ciprofloxacin (MIC 20.48 μg/ml, bactetiostatic rate 90.21%) and erythromycin (MIC 35.84 μg/ml, bactetiostatic rate 90.33%).ConclusionAllicin has anti-microbial activity on Campylobacter jejuniin vitro.

[Key words]allicin; ciprofloxacin; erythromycin; MIC; bacteriostatic rate

大蒜素是由大蒜的鱗莖中提取的一種有機硫化物，為大蒜的主要生物活性成分，化學名為二烯丙基三硫化物(diallyltrisulfide, DATS)。大蒜素具有降血壓、降血脂、抗心律失常、抑菌等多種藥理作用，因其具有很強的抗菌作用，也被稱為天然廣譜抗生素[1]。2012年國外報道，大蒜素對引起人類腹痛、腹瀉和發熱的彎曲桿菌有抑制作用。美國每年有240萬人發生腹痛、腹瀉和發熱等病。大蒜素能夠破壞空腸彎曲桿菌生物膜和減少細胞內三磷酸腺苷的數量，抑制細胞代謝，進而殺滅彎曲桿菌[3]。本實驗采用自行提取的大蒜素，研究其對空腸彎曲桿菌的抑菌作用，通過比較大蒜素、環丙沙星、紅霉素對空腸彎曲桿菌的抑菌效用，探討大蒜素的抑菌作用及強度。

1材料

1.1儀器CP225D微量電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)；UV-3200S紫外可見分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)； LC-10ATVP高效液相色譜儀(日本島津公司)；TDL-5B離心機(上海菲恰爾分析儀器有限公司)；TN-100C(Ⅱ)托盤扭力天平(上海良平儀器儀表有限公司)；RE-52旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；SH2-D(Ⅲ)循環水式真空泵(鞏義布予華儀器有限公司)；BC-J80S 二氧化碳培養箱(上海博訊實業公司)；XFS-280CB 手提式壓力滅菌器(浙江新豐醫療器械有限公司)；HR40-IIA2生物安全柜(青島海爾特種電器公司)；CN0025A CampyGen微需氧產氣袋(OXOID，英國)；厭氧罐(日本三菱瓦斯化學株式會社)；Transferpette微量移液器(德國)。

1.2試藥大蒜素對照品(含量為88.4%，中國食品藥品檢定研究院，批號：100384-201102)；大蒜素粗提取液(解放軍208醫院藥劑科實驗室自制，濃度為14.62mg/ml)；鹽酸環丙沙星(含量為99.30%，武漢勝天宇生物科技有限公司，批號：130601)；紅霉素(含量為92.50%，武漢勝天宇生物科技有限公司，批號：201304006)；環丙沙星藥敏紙片(OXOID，英國)；紅霉素藥敏紙片(OXOID，英國)；馬尿酸鈉(北京路橋技術有限責任公司，批號：130105)；茚三酮(北京陸橋技術有限責任公司，批號：130104)；甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純。

1.3菌株和培養基MH藥敏培養皿(批號：131031)，哥倫比亞血瓊脂平皿(批號：131106)，腦心浸液瓊脂(批號：130125)，布氏肉湯(批號：130312)均購自北京陸橋技術有限責任公司?？漳c彎曲桿菌(ATCC33291，上海信然實業有限公司)。

2方法

2.1菌株處理

2.1.1菌株的復蘇按菌株復蘇說明精密吸取菌株復溶培養基1ml于凍干菌株內，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解呈懸浮狀，用接種環挑取菌液直接劃線于哥倫比亞血瓊脂平皿，于42 ℃微需氧 (5%氧氣、10%二氧化碳和85%氮氣)[2]條件下培養48 h，得到復蘇的菌種[3]。

2.1.2菌株的培養用接種環挑取復蘇得到的單個菌落直接劃線于哥倫比亞血瓊脂平皿，于42 ℃微需氧條件下48 h傳代一次。

2.1.3菌株的保存[3,4]用接種環刮取哥倫比亞血瓊脂平皿表面的單個菌落，溶于含30%甘油的腦心浸液肉湯中，將菌濃度調到6個麥氏濃度，將制好的腦心浸液甘油菌懸液分裝于無菌離心管中，-70 ℃冷凍保存。

2.2菌株的鑒定[4]根據空腸彎曲桿菌菌落的生長特征、革蘭染色特征、過氧化氫酶實驗、氧化酶實驗、動力實驗、馬尿酸水解實驗、尿素酶實驗、25 ℃生長實驗和42 ℃生長實驗的結果，進行判定。

2.3藥敏實驗

2.3.1K-B 法大蒜素藥敏紙片的制備：用打孔器將濾紙制成6 mm的圓片，高壓滅菌后于無菌操作下，將濾紙片放入潔凈平皿內，每4層濾紙片滴加濃度分別為1 000、2 000和3 000μg/ml的大蒜素藥液20 μl，分別得到每片含大蒜素5、10和15 μg的藥敏紙片。陰性對照紙片滴加20 μl生理鹽水，將上述藥敏紙片于無菌安全柜中晾干，備用。

實驗菌的接種與藥敏紙片的貼放：用接種環挑取形態相似的單個菌落于滅菌生理鹽水中，校正濃度至0.5麥氏比濁標準的菌懸液(約含空腸彎曲桿菌1×108CFU/ml)。用無菌棉試子蘸取菌懸液，涂布于MH藥敏培養皿表面，每個平皿貼放6片藥敏紙片，分別為：環丙沙星(每片含環丙沙星5 μg)、紅霉素(每片含紅霉素15 μg)、大蒜素(每片分別含大蒜素5、10、15 μg)、生理鹽水為空白對照，其中空白對照貼于平皿中心。于42 ℃微需氧環境下培養18～24 h，觀察結果。用游標卡尺測量抑菌環的直徑，記錄結果，實驗重復3次。判定標準：按照美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)標準[5]。

2.3.2肉湯稀釋法試藥儲備液的制備：分別精密稱取環丙沙星51.56mg、紅霉素55.35 mg于10ml容量瓶中，加無菌注射用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，均制備成濃度為5 120 μg/ml的藥物儲液。精密量取大蒜素粗提取液3.50 ml(約相當于大蒜素51.20 mg)于10 ml容量瓶中，加1%吐溫-80溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為5 120 μg/ml的大蒜素儲液，-20 ℃保存備用。

菌懸液的制備[6]：按“2.3.1”項下實驗菌液制備濃度為0.5麥氏比濁標準的菌懸液(約含空腸彎曲桿菌1×108CFU/ml)，使用時用布氏肉湯將上述菌懸液進行1:1 000稀釋后備用(約含空腸彎曲桿菌1×105CFU/ml)。

最低抑菌濃度(MIC)的測定：①測定方法的選擇：采用分光光度法，分別取空白布氏肉湯及空腸彎曲桿菌樣品于200～800 nm波長范圍內進行掃描，結果空腸彎曲桿菌樣品在(600±1) nm波長處有最大吸收，空白布氏肉湯無干擾，故選擇600 nm為檢測波長。②單藥MIC的測定：取無菌試管39支，隨機分成3組，即環丙沙星組、紅霉素組、大蒜素組，每組13支，將每組試管標記為1～13號。每組1號試管中分別精密加入布氏肉湯5.23、5.33、5.76 ml，每組2～13號試管分別精密加入布氏肉湯3 ml，環丙沙星組1號試管中加入環丙沙星儲備液0.77 ml、紅霉素組1號試管中精密加入紅霉素儲備液0.67 ml，大蒜素組1號試管中精密加入大蒜素儲備液0.24 ml。將每組1號試管中藥物與布氏肉湯混勻，然后分別從每組1號試管中精密吸取3 ml至每組2號試管，混勻后從每組2號試管中再精密吸取3 ml至每組3號試管，如此連續倍比稀釋至每組11號試管，并從11號試管中精密吸取3 ml棄去，每組12號試管(3 ml布氏肉湯+3 ml菌液)作為空白生長對照，13號試管以滅菌布氏肉湯作為對照。然后每組1～12號試管中加入上述制備好的菌懸液3 ml，搖勻。環丙沙星組1～11號試管中環丙沙星藥物濃度見表3；紅霉素組1～11號試管中紅霉素藥物濃度見表4；大蒜素組1～11號試管中大蒜素藥物濃度見表2。從每組1～12號試管中精密吸取3 ml，于600 nm 波長處測定吸光度。剩余液體再于42 ℃微需氧條件下培養24 h，肉眼觀察細菌生長情況并測定吸光度，每組實驗重復3次。

A1:實驗組培養前的吸光度；A2：實驗組培養24 h后的吸光度；A1′：空白對照組培養前的吸光度；A2′：空白對照組培養24 h后的吸光度。

3結果與分析

3.1菌株的鑒定[4]肉眼觀察哥倫比亞血瓊脂平皿長出的菌落形態為不溶血，扁平，濕潤，有光澤，水滴樣，半透明。革蘭染色鏡檢為G-菌，形態大小為[(0.3～0.4 μm)×(1.5～3 μm)]，呈S形、螺旋狀。氧化酶實驗結果：空腸彎曲桿菌與試劑接觸10 s內呈深紫色。過氧化氫酶實驗結果：空腸彎曲桿菌與試劑接觸后0.5 min內產生氣泡。馬尿酸水解實驗結果：呈紫色。42 ℃生長實驗結果：空腸彎曲桿菌生長。動力實驗結果：穿刺線模糊，側光可觀察穿刺線周圍有生長痕跡；均為陽性。尿素酶實驗結果：試劑不變色。25 ℃生長實驗結果：空腸彎曲桿菌不生長；均為陰性。結果鑒定符合空腸彎曲桿菌性質。

3.2K-B法K-B 法是以抑菌圈的直徑表示抑菌作用的大小。結果顯示，3種藥物對空腸彎曲桿菌均有抑菌作用，其中大蒜素(含量1、2、3)與環丙沙星和紅霉素相比，均具有更為明顯的抑菌作用(P<0.05),結果見表1。

3.3肉湯稀釋法大蒜素、環丙沙星、紅霉素對空腸彎曲桿菌的MIC實驗及抑菌率，結果見表2。

本實驗以抑菌率≥90%的最小藥物濃度為MIC，結果顯示，大蒜素、環丙沙星、紅霉素的MIC分別為12.80、20.48和35.84 μg/ml，率分別為90.40%、90.21%和90.33%。

其對應抑菌

*P<0.05，與紅霉素、環丙沙星比較

表2　3種藥物的MIC及抑菌率

4討論

大蒜素具有多種藥理作用，現國內外已多有報道。近年來國外已有大蒜素對空腸彎曲桿菌抑菌作用的研究。截至筆者投稿，國內尚未見文獻報道大蒜素對空腸彎曲桿菌的抑菌作用。本實驗通過將大蒜素粗提取物與環丙沙星、紅霉素對空腸彎曲桿菌的抑菌作用進行比較，從而研究大蒜素的抑菌作用。

本實驗采用哥倫比亞血瓊脂平皿為固體培養基培養空腸彎曲桿菌，菌株生長情況良好。以布氏肉湯為液體培養基進行肉湯稀釋法實驗，本法簡單易行，可為微生物實驗室研究提供基礎。

采用K-B法和肉湯稀釋法比較大蒜素、環丙沙星、紅霉素對空腸彎曲桿菌的抑菌作用。上述兩種方法結果均顯示大蒜素抑菌作用強于環丙沙星和紅霉素。大蒜素的抗菌活性主要在于其能夠與含有巰基的酶相互作用，不可逆地抑制巰基蛋白酶的活性[7]。根據大蒜素的抗菌活性實驗結果表明，將大蒜素制成劑型，用于治療空腸彎曲桿菌的感染，可為臨床提供一種新的抗菌藥物。

本實驗結論大蒜素抑菌效果優于紅霉素和環丙沙星，與國外報道有差異[2]。大蒜素粗提取物的含量測定參照《中華人民共和國藥典(一部)》2010年版[8]，含二烯丙基三硫化物不含二烯丙基一硫和二硫化物，而國外資料沒有明確提出其成分，所用菌株是否存在差異。另外，我國自古以來常以大蒜作為調料和食品(如甜蒜)，能否產生細菌抗藥性，值得進一步研究。

【參考文獻】

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[2]Lu X, Samuelson DR, Rasco BA,etal.Antimicrobial effect of diallyl sulphide onCampylobacterjejunibiofilms[J]. J Antimicrob Chemother,2012,67(8):1915-1926.

[3]駱海明，陳倩.彎曲菌菌種冷凍保存及復蘇方法研究[J]. 中國食品衛生雜志,2007,19(6):518.

[4]韓新鋒，劉書亮，張曉利，等.雞肉空腸彎曲桿菌的分離鑒定及耐藥性分析[J]. 中國人獸共患病學報，2012,28(1)：31.

[5]Clinical and Laboratory Stanndards Institute.Approved standard M07-A8 methods for dilution antimicrobial susceptibiolity tests for bacteria that grow aerobically[S]. 8th ed.Villanova, PA:NCCLS,2009,29(2).

[6]孫長貴，曾向銘，楊燕.肉湯稀釋法酵母菌藥物敏感性試驗及質量控制介紹[J]. 江西醫學檢驗，2007,25(1)：57.

[7]陳振華，劉文恩. 碳青霉烯酶研究進展[J]. 國際檢驗醫學雜志，2010,31(6)：848.

[8]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版一部[S]. 北京：中國醫藥科技出版社，2010：23.

[本文編輯]李睿旻