用高效液相色譜法測定銀翹散配方顆粒中連翹酯苷A的含量

·研究報告·

用高效液相色譜法測定銀翹散配方顆粒中連翹酯苷A的含量

王嬋1，韋刃2，黃曉玉2，林廣3，黃志權3，周永強3(培力藥業有限公司, 廣西 南寧 530007)

[摘要]目的建立了銀翹散配方顆粒中連翹酯苷A的含量測定方法。方法采用高效液相色譜法，色譜柱為Welch Ultimate XB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇-0.2%冰醋酸溶液為流動相進行梯度洗脫，流速為1.0 ml/min，檢測波長為330 nm，柱溫20 ℃。結果連翹酯苷A進樣量在0.080 3～3.211 μg范圍內線性關系良好(r=1.000)。加樣回收率為103.78%，RSD為0.82%。結論該方法簡便、準確，專一性和重復性較好，可用于銀翹散配方顆粒的質量控制。

[關鍵詞]高效液相色譜法；銀翹散配方顆粒；連翹酯苷A

[基金項目]南寧市本級科學研究與技術開發計劃項目(20141060，20133163)；廣西創新計劃專項經費項目(2014CXJHA02)

[作者簡介]王嬋，助理工程師.研究方向：中藥配方顆粒質量標準研究.E-mail:cwang@purapharm.com.cn

[中圖分類號]R917[文獻標志碼]A

DOI[]10.3969/j.issn.1006-0111.2015.02.017

[收稿日期]2013-08-10[修回日期]2014-02-20

Content determination of Forsythoside A in Yinqiaosan granules by HPLC

WANG Chan1,WEI Ren2,HUANG Xiaoyu2,LIN Guang3,HUANG Zhiquan3,ZHOU Yongqiang3(PuraPharm Corporation,Nanning 530007，China)

Abstract[]ObjectiveTo establish a method for determination of the content of Forsythoside A in Yinqiaosan granules.MethodsHPLC method was adopted to carry on the determination. Welch Ultimate XB-C18 column (250 mm×4.6 mm，5 μm) was used with the mobile phase of methanol-0.2% Glacial acetic acid solution by gradient elution. The flow rate was 1.0 ml/min, the detection wavelength was 330 nm, and the column temperature was 20 ℃.ResultsForsythoside A showed a good linear relationship at the range from 0.080 3～3.211 μg (r=1.000).The average recovery rates were 103.78%, and RSD=0.82%.ConclusionThe method was convenient and accurate. Meanwhile, it also has good specificity and reproducibility. It can be used effectively for the quality control of Yinqiaosan granules.

[Key words] HPLC;Yinqiaosan granules；Forsythoside A

銀翹散配方顆粒(Yinqiaosan granules)由金銀花、連翹、荊芥、桔梗等十味中藥組成，具有疏散風熱、清熱解毒的功效，主治溫病初起，邪在衛分，癥見發熱無汗，或汗出不暢，微惡風寒，頭痛口渴，咳嗽咽痛，舌尖紅，苔薄白或薄黃，脈浮數。方中重用金銀花、連翹為君，既有辛涼透表、清熱解毒的作用，又具芳香辟穢的功效[1]。有研究表明，連翹中發揮抗菌作用的主要是連翹酯苷，其具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抑制彈性蛋白酶活力以及松弛血管等藥理作用[2]。連翹中連翹酯苷包括連翹酯苷(Forsythoside)A、B、C、D、E等，尤以連翹酯苷A含量最高[3]?！吨腥A人民共和國藥典》(2010版)新增了連翹酯苷A作為連翹藥材的質量控制指標。本實驗采用高效液相色譜法對銀翹散配方顆粒中連翹酯苷A做含量測定。結果表明，本法操作簡便，穩定性、重現性好，測定結果準確，可作為銀翹散配方顆粒的質量控制。

1儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，GR-202分析天平(日本)，昆山KQ-500DE超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。連翹酯苷A對照品(批號：111810-201103，含量以92.9%計，中國食品藥品檢定研究院)，銀翹散配方顆粒[批號：A1300010，培力(南寧)藥業有限公司]；甲醇(歐普森)為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2方法與結果

2.1色譜條件色譜柱：Welch Ultimate XB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以甲醇為流動相A，0.2%冰醋酸為流動相B，按表1進行梯度洗脫；流速1.0 ml/min；進樣量：對照品溶液10 μl，供試品溶液20 μl；柱溫20 ℃；檢測波長330 nm，理論塔板數按連翹酯苷A峰計算應不低于3 000。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液取連翹酯苷A對照品適量，精密稱定，加含0.5%冰醋酸的50%甲醇溶液制成80 μg/ml的對照品溶液，即得。

表1　梯度洗脫程序

2.2.2供試品溶液取本品適量，研細，取約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入50%甲醇50 ml，稱重，超聲處理(功率400 W，頻率40 kHz)45 min，取出，放冷，稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.3陰性樣品溶液取缺連翹藥材的銀翹散配方顆粒陰性樣品，研細，取約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 ml，稱重，超聲處理(功率400 W，頻率40 kHz)45 min，取出，放冷，稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3專一性考察分別吸取對照品溶液10 μl、供試品溶液和陰性樣品溶液各20 μl進樣。在“2.1色譜條件”下，供試品中連翹酯苷A色譜峰與對照品色譜峰保留時間一致，并與其他共存成分最小分離度為1.83，理論塔板數為17 206，主峰與雜質峰達到基線分離，且陰性樣品在相應的位置沒有色譜峰干擾，說明本方法專一性良好(圖1)。

圖1　連翹酯苷A高效液相色譜圖 A.對照品；B.供試品；C.陰性樣品；1.連翹酯苷A

2.4線性關系考察分別精密量取濃度為0.321 1 mg/ml的對照品溶液0.25、0.50、1.0、2.0、5.0 ml，置10 ml量瓶中，加含0.5%冰醋酸的50%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，得線1至線5，并取0.321 1 mg/ml的對照品溶液作為線6。精密吸取線1至線6對照品溶液各10 μl，進行測定。以進樣量(μg)為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為Y=1 668.805 5X-12.496 2(r=1.000)。結果表明，連翹酯苷A在0.080 3～3.211 μg范圍內線性關系良好。

2.5精密度實驗精密吸取連翹酯苷A對照品溶液(濃度為32.11 μg/ml)10 μl，重復進樣6次，測定峰面積。結果表明，連翹酯苷A峰面積的RSD=2.43%，說明儀器精密度良好。

2.6穩定性實驗取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、13 h進樣，依法測定，結果連翹酯苷A峰面積的RSD=0.75%，說明供試品溶液在13 h內穩定。

2.7重復性實驗取同一批樣品，研細，取6份，每份約1.0 g，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制得供試品溶液，精密吸取供試品溶液各20 μl進樣，測峰面積并計算連翹酯苷A的含量。結果連翹酯苷A的平均含量為0.965 mg/g，含量的RSD為0.56%，說明本方法重復性較好。

2.8加樣回收率實驗稱取同一批已知含量為0.965 mg/g的樣品，研細，取6份，每份約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入濃度為0.605 mg/ml的連翹酯苷A對照品溶液0.8 ml， 蒸干， 按“2.2.2”項下方法制得供試品溶液， 進樣測定，計算回收率，分別為103.20%、103.12%、102.79%、104.38%、104.88%和104.34%，平均回收率為103.78%，RSD為0.82%，說明本方法回收率良好。

2.9樣品測定取本品6批，每批取2份，每份約1.0 g，精密稱定，按“2.2.2 ”項下方法制得供試品溶液，按“2.1色譜條件”進樣測定，結果見表2。

表2　6批銀翹散配方顆粒含量測定結果( n=6，mg/g)

3討論

3.1流動相的選擇本實驗曾參考《中華人民共和國藥典(一部)》2010年版中[連翹]含量測定項，使用乙腈-0.4%冰醋酸(15:85)作為流動相進行測定，結果連翹酯苷A峰與相鄰雜質峰分離不佳、峰形差；亦曾考察不同的流動相系統：乙腈-0.2%磷酸水溶液梯度洗脫、甲醇-磷酸水溶液梯度洗脫[4，5]、乙腈-0.4%冰醋酸水溶液等度及梯度洗脫[6，7]、甲醇-0.2%冰醋酸梯度洗脫，結果以甲醇-0.2%冰醋酸梯度洗脫分離效果最好，峰形最佳。

3.2供試品制備方法的考察考察提取溶劑種類時，對甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇、70%乙醇、50%乙醇等提取溶劑進行比較，發現使用50%甲醇作為提取溶劑時，測得含量較高且峰形最好，因此選擇50%甲醇作為提取溶劑。另對提取方式(加熱回流、超聲處理、浸泡處理)，提取時間(30、45、60 min)，提取溶劑用量(25、50、100 ml)進行了優選。優選方案為：加溶劑50 ml，超聲處理45 min。

3.3對照品配制用溶劑的選擇連翹酯苷A含酚類結構，其結構較為復雜，在高濕、強光下不穩定[3]。本研究發現，當使用含有水的甲醇溶液配制時，對照品溶液放置幾小時后就會分解(HPLC測定可發現在主峰前有明顯的分解峰，且主峰的峰面積有明顯的下降)；使用不含水的純甲醇配制，對照品溶液放置幾天后峰面積亦會降低。有研究報道稱，酸性介質或抗氧劑的加入有利于改善連翹酯苷A在水溶液中的穩定性[3]。因此，筆者嘗試通過在50%甲醇中加入0.5%冰醋酸作為溶劑配制對照品溶液以提高其穩定性，測定結果表明，此法效果顯著，對照品溶液放置20 d后峰面積亦無明顯變化。

【參考文獻】

[1]段富津.方劑學[M].上?？茖W技術出版社.1995: 28.

[2]付鵬亮，王東強，李志軍. 連翹酯苷藥理作用研究進展[J]. 長春中醫藥大學學報，2011, 27(6):1062-1063.

[3]王曙賓, 鄭亞杰. 連翹提取物和連翹酯苷A 原料中連翹酯苷A的穩定性研究[J]. 中草藥, 2010, 41(6)：909-911.

[4]鮑涵，張忠義，張軍，等. HPLC法同時測定熱毒清顆粒中綠原酸和連翹酯苷A的含量[J]. 中國藥房，2012,23(24)：2284-2286.

[5]蔡穎. HPLC法測定小兒肺熱咳喘口服液中連翹苷和連翹酯苷A的含量[J]. 齊魯藥事,2012,31(6):333.

[6]劉鵬, 宋迎權. HPLC法測定雙黃連顆粒中連翹酯苷A的含量[J]. 中國中醫藥現代遠程教育, 2011, 9 (19):158.

[7]趙昱瑋,于淼，南敏倫，等.高效液相色譜法測定銀翹解毒片中連翹酯苷A的含量[J].中國醫藥科學,2011,1(22):114.

[本文編輯]李睿旻