普萘諾爾對血管內皮細胞增殖和凋亡影響的體外實驗

張定濤，何輝霞，羊書勇，吳 坡，蔣 佶，鄭維銀

普萘諾爾對血管內皮細胞增殖和凋亡影響的體外實驗

張定濤，何輝霞，羊書勇，吳 坡，蔣 佶，鄭維銀

目的觀察不同濃度的普萘諾爾對人血管內皮細胞的增殖和凋亡的影響,為普萘諾爾治療血管瘤的機制研究提供依據。方法 取體外培養的人臍靜脈血管內皮細胞（HUVECS），胰酶消化后制成單細胞懸液，常規培養，在達對數生長期時，加入不同濃度的普萘諾爾干預，24 h后采用MTT法檢測各組細胞的增殖率，流式細胞儀Annexin V-FI雙染法檢測細胞凋亡率。結果 作用24 h后，128 μg/ml以上濃度的普萘諾爾明顯抑制人血管內皮細胞的增殖，而且能夠明顯增加血管內皮細胞的凋亡。結論 普萘諾爾對人血管內皮細胞的增殖有抑制作用，并能夠誘導人血管內皮細胞凋亡。

普萘諾爾；血管內皮細胞；細胞增殖；凋亡；抑制

血管瘤是嬰幼兒期最常見的良性腫瘤，是由血管內皮細胞異常增殖導致的。血管瘤好發于面頸部，可能影響面部器官功能及外觀，甚至危及生命。偶然發現的β受體阻斷劑普萘洛爾可以治療血管瘤，于2008年首次被報道[1]，使口服普萘洛爾成為治療血管瘤的一種新方法。這種方法療效確切，患者耐受較好，但對其治療機制不甚明確。本研究采用體外實驗，通過觀察普萘洛爾對人臍靜脈血管內皮細胞（HUVECS）增殖及凋亡的影響，探討了普萘洛爾治療血管瘤的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 HUVECS細胞株，購自武漢大學典型物種保存中心；鹽酸普萘洛爾，購自華中藥業股份有限公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自北京碧云天公司；流式細胞儀(CyFlow RML型)購自德國PAR TEC公司。

1.2 實驗方法 將液氮中凍存HUVECS細胞解凍復蘇后，加入適量的培養基,1000 r/min離心5 min，棄去上清液，再次加入培養基，調整細胞濃度至1× 105個/cm3后，將細胞接種于培養板中，傳代培養至第3代，調整細胞密度為2×105個/cm3，分裝至培養板，實驗組加入不同濃度普萘洛爾 （32、64、128和256 μg/ml），每組3個復孔，對照組不加藥物只加細胞及培養液，繼續培養24 h。

1.2.1 MTT法檢測HUVECS抑制率 各組細胞繼續培養24 h后，每孔加入5 g/L MTT溶液10 μl，繼續培養4 h；吸出孔內培養液，每孔加入DMSO 200 μl(0.5 g/L），于室溫下振蕩10 min。酶標儀檢測波長490 nm處的每孔吸光度(OD值）?？瞻卓變H加培養液，繪制HUVECS生長曲線，計算普萘洛爾對HUVECS的抑制率。

1.2.2 流式細胞儀檢測HUVECS凋亡率 取對數生長期的HUVECS細胞，接種于6孔板，加入2 ml 含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基，培養24 h，達對數生長期后，再用不含血清的培養基饑餓培養，使細胞同步化到達G0期，更換培養基并加入普萘洛爾共2 ml，使藥物濃度為32、64、128和256 μg/ml。藥物作用細胞24 h后，吸出至2個1.5 ml的EP管中，各用1 ml PBS洗滌貼壁細胞2次，加入胰酶消化，200 μl PBS重懸細胞，調整細胞密度為1×106個/ml; 取100 μl細胞至5 ml管，加入200 μl annexin-VFITC；20～25℃水浴箱中避光孵育30 min后,加入10 μl碘化丙啶染色液（PI）混勻，加入1 ml PBS，隨即進行流式細胞術檢測HUVECS凋亡率。

1.3 統計學方法 采用 SPSS19.0軟件進行統計處理，計量資料以均數±標準差表示，采用單因素方差分析檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 普萘洛爾對體外培養HUVECS形態的影響普萘洛爾作用于HUVECS 24 h后，倒置顯微鏡下觀察，部分細胞梭形變為不規則，細胞間隙增大，細胞黏附力降低，可見核分裂相及細胞碎片（圖1）。

圖1 普萘洛爾對HUVECS形態的影響（×100）

2.2 普萘洛爾對HUVECS生長的抑制率 從表1可見，隨著普萘洛爾濃度的提高，對HUVECS生長的抑制率逐漸增高。當濃度＞128 μg/ml時，對HUVECS增殖抑制作用明顯，抑制率與對照組相比差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。

2.3 普萘洛爾誘導HUVECS凋亡的檢測結果隨著普萘洛爾濃度升高，HUVECS凋亡率增加，普萘洛爾濃度達到128 μg/ml后，早期凋亡細胞和凋亡細胞總數計數中，實驗組與對照組比較均有明顯差異(P＜0.05，圖2、表2)。

圖2 普萘洛爾誘導HUVECS凋亡流式細胞術檢測結果

3 討論

作為嬰幼兒期常見的良性腫瘤，嬰幼兒血管瘤（infantile hemangiomas，IH）60%發生在面頸部[2]，它是由血管內皮細胞異常增殖引起，臨床可分為增殖期、消退期和消退后期。雖然IH大都可以自然消退，因好發于面頸部，影響患兒容貌；如位于眼部、呼吸道的IH，可能會引起器官的功能障礙（如弱視、呼吸受阻）；同時常伴發潰瘍、出血等。雖然可以自然消退，但部分會遺留有色素異常、皮膚皺縮等并發癥，故目前學者多建議在增殖期行早期干預治療[2]。Leaute-Labreze等[1]于無意中發現β受體阻滯劑普萘洛爾可用于嬰幼兒血管瘤治療,隨后立即得到了推廣并取得了良好的效果[3-4]，并建議將普萘諾爾取代皮質類固醇激素成為IH治療一線藥物[1,5]。雖然目前有大量文獻報道了普萘諾爾對IH的良好臨床治療結果，但對于其治療機制仍知之甚少。

為探討普萘諾爾對血管瘤的作用機制，本研究檢測了普萘諾爾體外對血管內皮細胞凋亡和增殖的影響，通過對體外HUVECS的培養，并以MTT實驗觀察了普萘諾爾對HUVECS增殖的作用，發現128 μg/ml以上濃度對HUVECS的增殖有明顯的抑制作用。流式細胞儀檢測的結果顯示，隨著普萘諾爾濃度的增加，HUVECS凋亡率逐漸提高，早期凋亡率和晚期凋亡率均逐漸增高，128 μg/ml以上濃度與對照組比較有明顯促進凋亡作用，呈現出劑量依賴效應。

普萘諾爾可能是通過下調VEGF的mRNA表達，減低血管內皮細胞的VEGF表達，從而抑制HUVECS增殖和分化[6-7]。血管內皮細胞可以表達β腎上腺素能受體，刺激血管內皮細胞增殖[8]，而β受體阻滯劑普萘諾爾則可以拮抗β腎上腺素能受體，阻止細胞增殖。另有體外實驗證實，普萘諾爾可以通過影響有絲分裂原激活蛋白激酶MAPK和蛋白激酶A（PKA）/花生四烯酸（AA）細胞信號通路，誘導細胞凋亡[6]。又有學者認為，普萘諾爾在下調VEGF的合成同時，還可促進血管內皮細胞脂肪化，而不是促進其凋亡[9]。

由此可見，普萘諾爾治療血管瘤的機制和對血管內皮細胞的影響還不是十分清楚，尚需進一步研究。

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Effects of propranolol on apoptosis and proliferation of vascular endothelial cells in vitro

Zhang Dingtao,He Huixia,Yang Shuyong,Wu Po,Jiang Ji,Zheng Weiyin Department of Stomatology,General Hospital of Chengdu Military Command,Chengdu,Sichuan,610083,China

ObjectiveTo explore the effects of propranolol in different concentrations on the proliferation and apoptosis of human vascular endothelial cell in vitro in order to provide reference for the research on the mechanism of the treatment on hemangioma with propranolol.MethodsUnfrozen HUVECSs were cultured in vitro and made into unicell suspension after trypsinization.After conventional culture,different concentration of propranolol was added for the intervention when the culture had reached the logarithmic phase.24 h later,the growth rates of the cells were detected by MTT,and the apoptosis rates were tested by flow cytometry instrument Annexin V-FI.ResultsAfter the cells were treated for 24 h,propranolol with the concentration of 128 μg/ml and above could significantly inhibite the proliferation of the HUVECSs and increase the apoptosis.ConclusionPropranolol can effectively inhibit the proliferation of human vascular endothelial cells and promote the apoptosis．

propranolol;vascular endothelial cell;cell proliferation;apoptosis;inhibition

R 732.2

A

1004-0188（2016）04-0370-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.04.008

2016-01-07）

610083成都,成都軍區總醫院口腔科

鄭維銀，E-mail:weiyinzheng@hotmail.com