細胞因子和應力對骨髓間充質干細胞成骨分化的影響

張淋坤 綜述，趙志河 審校

（天津市口腔醫院口腔正畸科，天津 300041）

細胞因子和應力對骨髓間充質干細胞成骨分化的影響

張淋坤 綜述，趙志河 審校

（天津市口腔醫院口腔正畸科，天津 300041）

細胞因子；力；骨髓間充質干細胞；成骨分化

間充質干細胞是一種具有多向分化潛能的成體干細胞。骨髓中間充質干細胞的數量最多，稱為骨髓間充質干細胞（BMSCs）；其它來源于外胚層的組織或發育過程中含有外胚間充質的組織已證實含有間充質干細胞的有皮膚、脂肪、牙周膜等[1-2]。BMSCs屬于成纖維樣細胞，在不受任何刺激的情況下體外培養，細胞形態與成纖維細胞非常相似，不易區分，成紡錘形或長梭形。BMSCs在相應的培養環境中可以向成骨、軟骨、神經、脂肪、心肌等多方向分化。隨著在體外傳代次數的增加，BMSCs的增殖能力、成骨和成脂分化的能力均有所降低，而成軟骨能力卻沒有明顯下降；其成骨、成軟骨和成脂能力均可以保持到細胞衰老。多種誘導因素均可刺激BMSCs向成骨細胞分化，其中細胞因子和力學因素起著很重要的作用。

1 細胞因子

在BMSCs成骨分化的過程中，多種細胞因子發揮了重要作用。其中作用比較明確的有骨形成蛋白（BMPs），轉化生長因子β（TGF-β），白細胞介素6及其受體（IL-6/IL-6R）等。

1.1 骨形成蛋白（BMPs）

骨形成蛋白屬于轉化生長因子超家族，是強的成骨誘導因子之一，可以啟動BMSCs成骨分化過程。BMPs可能是誘導BMSCs向成骨方向分化的基本信號分子。其中誘導成骨作用最強的是BMP-2、4、7。BMPs在誘導BMSCs成骨分化的同時，可以抑制BMSCs向其他方向（比如成脂方向）分化，從而有利于骨的生長和再生。BMPs的合成與分泌受到較多因素的影響。將人BMP-2基因轉染進入BMSCs，可以被BMSCs大量表達，顯著提高BMSCs的成骨分化能力[3]。巨噬細胞可以通過分泌BMP-2來誘導BMSCs向成骨細胞分化，這在受傷的骨組織中尤為明顯[4]。粒細胞集落刺激因子（GCSF）過表達時，會減少BMP-2的生成，從而抑制成骨細胞的產生[5]。磷酸二酯酶抑制劑，如己酮可可堿，則可能通過促進cAMP產生來增強BMP-4的誘導成骨功能[6]。BMP-2、4是BMSCs成骨分化信號轉導的關鍵環節，Liu等[7]在研究不同材料對BMSCs成骨分化的影響時發現羥基磷灰石納米支架材料可以顯著上調BMSCs內BMP-2/4、Runx 2、堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原和整合素的表達，并且在整合素—BMP/Smad信號通路的關鍵調節蛋白Smad1/5/8出現明顯的核內定位以后，骨鈣素的表達顯著上調，從而證明整合素—BMP/Smad信號通路的激活可以明顯促進BMSCs的成骨分化。組織工程領域的研究顯示，BMPs可以吸附于支架材料上并可以實現緩釋，Wang等[8]將BMP-2吸附于納米仿生羥基磷灰石包被的京尼平-殼聚糖共軛支架材料，實現了連續14 d的緩釋；在這14 d中，BMSCs成骨標志物堿性磷酸酶、Runx 2、骨鈣素的上調持續了14 d，骨橋蛋白的上調持續了3 d，從而證明了BMP-2對BMSCs成骨分化具有明顯的促進作用。

BMPs和其他細胞因子之間以及BMPs之間存在著復雜的協同作用機制。松弛肽對BMP-2誘導的BMSCs成骨分化有明顯的協同促進作用。BMP-2通過與其受體Rxfp 1結合，激活BMSCs內的Smad、P38信號通路，上調Runx 2的表達和活性，從而促進BMSCs成骨分化。而松弛肽一方面可以通過與BMP-2的協同作用直接強化上述作用，另一方面可以直接上調BMP-2受體Rxfp 1的表達，從而與BMP-2發生協同作用，強化BMP-2對BMSCs成骨分化的誘導作用[9]。BMP-4和BMP-7聯合應用促BMSCs成骨分化的作用明顯強于單獨應用BMP-4或BMP-7[10]，BMP-4可以上調血管內皮細胞生長因子（VEGF）的表達，而敲除BMP-6基因也可以上調VEGF的表達，BMP-2可以上調表皮細胞生長因子（bFGF）的表達，BMP-5可以上調SDF-1，這些因子與BMP之間存在相互作用，BMPs之間可以通過這些因子發揮協同作用[11]。

由于BMP-2具有顯著的促進成骨分化的作用，可以將其作為治療骨質疏松和骨缺損的潛在藥物進行開發。為了觀察BMPs對于骨質疏松的治療作用，Li等[12]對6月齡雌性SD大鼠行雙側卵巢切除術（去勢大鼠），術后3個月行X線檢查證實去勢大鼠已罹患骨質疏松；然后取其BMSCs進行培養，并在實驗組培養基中加入重組人BMP-2（rhBMP-2）；2周后發現實驗組鈣結節明顯多于對照組，堿性磷酸酶活性和血管內皮細胞生長因子（VEGF）的表達均明顯高于對照組，從而證實BMP-2可以通過上調VEGF表達的機制促進去勢大鼠的BMSCs成骨分化。治療骨缺損方面，BMP-2可以誘導BMSCs歸巢，并通過這種機制加速骨愈合和再生。Gohil SV等[13]制造了顱骨缺損的動物模型，然后在缺損部位局部應用rhBMP-2和（或）植入BMSCs，二者發現單獨和聯合應用都可以促進骨缺損的愈合，而且成骨現象并不僅僅局限于缺損部位，其周邊正常骨組織也發生了顯著的成骨現象。Zhang等[14]將含有BMP-2的絲綢支架材料植入裸鼠皮下，自尾靜脈注入BMSCs，觀察到BMSCs明顯聚集于含有BMP-2的絲綢支架材料的植入部位，從而證實了BMP-2對BMSCs歸巢的趨化作用；同一研究又將含有BMP-2的絲綢支架材料植入兔的骨缺損部位，從耳緣靜脈注入BMSCs，觀察到了更強的BMSCs歸巢作用，Micro-CT和組織切片發現骨缺損處的骨質再生受到了明顯的促進。

1.2 轉化生長因子β（TGF-β）

關于TGF-β的成骨誘導效應有兩方面的觀點：Locklin等[15]認為TGF能夠抑制BMSCs的增殖，能提高其ALP的表達，并能減少和延遲BMSCs成脂分化；而現在比較普遍的觀點認為TGF-β主要通過促進細胞分裂增殖促進成骨細胞產生和Ⅰ型膠原合成、促進基質鈣化等作用來增強骨損傷的修復能力。Zhao等[16]在鼠BMSCs的培養液中加入轉化生長因子β1（TGF-β1），2周后發現BMSCs對成骨分化標志物Runx 2、骨橋蛋白和Ⅰ型膠原的表達上調了7倍，堿性磷酸酶活性顯著提高，而成脂分化標志物PPARγ的表達顯著降低，從而證明TGF-β1的促成骨分化效應。TGF-β的促細胞分裂增殖作用使間充質細胞、軟骨細胞和成骨細胞數量大量增加，這不僅為BMP誘導成骨提供了更多的靶細胞，也為骨組織再生修復提供了物質基礎。TGF-β的作用有賴于轉化生長因子β激酶（transforming growth factor-β activated kinase，TAK）的活性，松弛肽可以提高TAK的活性，從而與TGF-β發生協同作用，促進BMSCs成骨分化[9]。

1.3 白細胞介素6及其受體（IL-6/IL-6R）

關于IL-6/IL-6R誘導BMSCs成骨分化的研究，目前存在兩種觀點：Taguchi等[17]學者認為，BMSCs表達IL-6R，IL-6與之結合后，可以激活JAK/STAT信號轉導通路，誘導未定型的BMSCs分化，使ALP活性增強，表現出成骨表型。然而，另有學者認為IL-6只是對骨源性成骨細胞或骨髓瘤細胞具有誘導成骨作用，對未定型的BMSCs誘導成骨作用并不明顯[18]；而在地塞米松（Dex）等輔劑作用下已有明確成骨傾向的BMSCs中加入可溶性IL-6（sIL-6）或IL-6/sIL-6R時，BMSCs的成骨作用加強，這主要是通過BMSCs表達的Gp130來實現的[15]。然而Rauner和Guzmán-Morales兩個課題組分別研究了地塞米松（DEX）在促進BMSCs成骨分化的同時，炎癥因子的表達，發現在成骨分化的過程中，BMSCs對集落細胞刺激因子（GM-CSF）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β、4、6、10（IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10）等炎癥因子的表達都是被抑制的，與此同時Runx 2、堿性磷酸酶的表達明顯上調，細胞外基質的礦化也顯著加強。Rauner課題組還發現在DEX誘導的BMSCs成骨分化早期，BMSCs的增殖被提高了7%～10%，而凋亡被抑制了25%～30%[19-20]。

2 力學刺激

2.1 張應力對BMSCs分化的影響

張應力可以促進BMSCs向成骨方向分化已經成為學術界的共識。Jagodzinski等[21]對人BMSCs施以1 Hz、2%和8%的軸向張應力，發現8%的形變大小能夠顯著提高ALP、骨鈣素（osteocalcin）、I型膠原和Runx 2的表達，而2%的形變大小與對照組相比沒有明顯變化。Simmons等[22]使用成骨誘導培養基培養人BMSCs，同時施加0.25 Hz、3%的周期性雙軸拉伸，與未加載的對照組相比，周期拉伸刺激后細胞基質礦化提高2.3倍，而且BMSCs呈現出更加成熟的成骨細胞表型。Koike[23]通過Flexercell系統研究雙軸張應力對干細胞系ST2成骨分化的影響，發現較低力值（0.8%～5%）下張應力能夠更有效地促進成骨分化。Grottkau[24]比較了相同力值的機械張應力對BMSCs和脂肪干細胞 （ASCs）成骨分化的影響，發現ASCs在收到張應力作用后，細胞排列方向改變為垂直于張應力方向，而BMSCs的排列沒有明顯改變；稱骨標志物Runx 2和Osterix的表達無論開始上調的時間還是表達量都沒有明顯差異，而骨鈣素和BMP-2的表達量雖然沒有差異，但是開始上調的時間BMSCs明顯晚于ASCs，從而說明ASCs和BMSCs都可以在張應力的誘導下向成骨細胞方向分化，但ASCs較BMSCs對張應力的反映更加敏感。

2.2 壓應力對BMSCs分化的影響

對成骨細胞的研究顯示，壓應力可以刺激人成骨細胞系高表達骨涎蛋白和骨形成蛋白（BMP）并且低表達它們的拮抗物，從而誘導成骨[25]。受到這項研究結果的啟示，同一課題組又將壓應力作用于干細胞，并研究其分化方向，發現壓應力可以顯著增強干細胞成骨 （Runx 2、Msx 2、Dlx 5、Osterix）和成軟骨（Sox 5，9）標記物的表達水平，同時降低成?。∕yoD）和成脂（PPARγ）標記物的表達水平[26]。這說明，壓應力可以誘導干細胞向成骨和成軟骨方向分化；信號通路的研究顯示，壓應力促進成骨和成軟骨是通過不同的信號通路進行的。壓應力可以通過P38MAPK途徑提高Runx 2的表達，從而促進干細胞向成骨方向分化[26]。同時，壓應力還可以通過BMPs途徑誘導干細胞向成軟骨方向分化，Wang等[27]將周期性壓應力加載到大鼠BMSCs觀察期成軟骨分化，發現周期性壓應力不僅可以直接誘導BMSCs成軟骨分化，同時可以促進BMSCs增殖，并提高其數量和活力，上調Ihh,Cyclin D 1,CDK 4,和Col2α1的表達；在此過程中MEK/ERK和P38 MAPK信號通路沒有參與，而BMP信號通路卻扮演者重要角色。

2.3 流體剪切力對BMSCs分化的影響

由于骨組織內存在大量的微管，外界的應力作用于骨組織產生的應變，必然引起這些微管內的液體的流動，這就會給成骨細胞帶來流體切應力的影響。因此，流體切應力對成骨類細胞的影響就成了研究的熱點。

對于成骨細胞的研究發現，流體切應力可以促進成骨細胞的分化成熟，抑制其凋亡；并誘導成骨細胞表達成骨相關基因和蛋白，而這種效應與流體切應力的大小，作用時間，細胞培養條件等因素有密切關系[28]。

BMSCs在流體切應力作用下的分化效應，不同的研究者有著不同的看法。Riddle等[29]認為不同大小的流體切應力可以通過MAPK途徑和鈣離子通道促進BMSCs的增殖，而Li等[30]卻認為周期性流體切應力可以明顯的使BMSCs向成骨方向分化，同時量效和時效研究發現2.0 Pa的流體切應力作用下3 min后，就可以觀察到鈣沉積的顯著提高，而1.0 Pa的流體切應力作用2 h后，BMSCs的成骨相關基因也顯著表達。分析這些研究結果存在差異的原因，可能和各研究者的研究目的不同，所選指標不同，施加的流體應力的大小、作用時間等不同所導致。

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（2015-11-12收稿）

R318

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.02.022

張淋坤（1975-），男，副主任醫師，博士。E-mail:zlkxjtu@163.com