探討胸腹水液基細胞學剩余標本制作細胞塊的方法

朱淑玲 楊清緒 武彤彤 吳惠如

探討胸腹水液基細胞學剩余標本制作細胞塊的方法

朱淑玲 楊清緒 武彤彤 吳惠如

目的探討胸腹水液基細胞學剩余標本制作細胞塊的方法。方法200份(200例患者)行胸腹水薄層液基細胞學檢測技術(TCT)的剩余標本,根據細胞學診斷結果分為A組與B組,每組100例,A組采用細胞塊試劑盒法處理后制作石蠟細胞塊,B組采用蛋清液作為支架法處理后制作石蠟細胞塊,對比分析兩種方法制成的細胞切片上的惡性細胞檢出率、細胞分布狀況和形態特征,并初步比較細胞塊和組織塊免疫化學染色效果。結果200例行胸腹水TCT檢測患者惡性細胞檢出率為16.0%(32/200),其剩余標本經細胞塊法檢測出的總惡性細胞檢出率為45.5%(91/200),其中A組惡性細胞檢出率53.0%(53/100)高于B組38.0%(38/100),差異具有統計學意義(P＜0.05)。結論細胞塊試劑盒與蛋清液作為支架方法比較,前者可提高胸腹水液基細胞學剩余標本的惡性細胞檢出率,同時可用于免疫細胞化學的檢測。

胸腹水液基細胞學；剩余標本；細胞塊

細胞塊制備是重要的細胞學檢查技術之一,它不僅有助于觀察細胞團的結構,還可以做免疫組織化學檢查和分子病理檢查,對于疾病診斷具有重要的意義,已越來越多地用于各種細胞學檢查之中［1,2］。細胞塊制備方法簡便省時,經濟快速,無需額外的材料(如瓊脂、凝血酶、蛋清等)幫助固定標本,通?？梢栽诖┐淌中g的第2天得到細胞塊切片甚至免疫組織化學等染色的結果［3］。傳統的細胞學制片存在一定的缺陷。本研究探討胸腹水液基細胞學剩余標本制作細胞塊的方法,現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院2012年1月～2015年1月行胸腹水TCT檢測的200份(200例患者)剩余標本,其中胸水138例,腹水62例,男85例,女115例,年齡45～81歲,平均年齡(60.3±8.7)歲。根據細胞學診斷結果將200例患者分為A組與B組,每組100例。

1.2 儀器與試劑 儀器：沉降式制片染色機(安必平醫藥科技公司)、自動樣本轉移機、低速離心機、振蕩器、快速混勻器。試劑：緩沖液、蘇木素、EA/OG染色劑、無水乙醇等。

1.3 方法

1.3.1 A組采用細胞塊試劑盒法 將常規細胞學檢查剩余的細胞學標本移入20～50ml離心管,1000 r/min離心5min,離心沉渣較少者移出上清液,重復加入細胞學標本并離心,直到離心沉渣滿足要求。離心管內保留上清液1.5～2.5ml,輕輕混勻,移入專用離心管,色澤較淺的標本可適當滴加伊紅試劑染色,靜置10min后,放入水平式離心機1500 r/min離心5min；取出細胞塊收集環,細胞混懸液中的細胞成分被收集至細胞塊收集環中,形成固定大小形狀的固體細胞塊,從上部滴加1～2滴瓊脂液(已加熱至50～60℃),室溫冷卻,連同收集環用脫水紙包裹后放入脫水盒,4%中性甲醛固定液固定6～8 h,即可進入脫水機常規脫水處理。細胞包塊制作切片后,HE染色、鏡檢,做出單獨細胞包塊診斷；結合細胞學涂片和細胞包塊切片做出細胞病理學診斷。

1.3.2 B組采用蛋清液支架法 制作前先用蛋白液涂片,然后曬30min左右,干燥備用。標本瓶用振蕩器震蕩15 s,取4ml細胞分離提取液置離心管內,用注射移液器穿抽吸樣品8次使細胞混合均勻,抽取8ml樣品液置離心管,把離心管平衡放進離心機,以轉速1000 r/min轉速離心2min,吸去上清液8ml,余下約4ml,再以轉速2000 r/min轉速離心10min,傾倒出上清液體,并用吸水紙吸去管口的液體。震蕩25 s/管,靜置10min,加入緩沖水1000 μl,抽吸8次后轉移400 μl置制片艙。轉移細胞時移液加樣器TIP頭居中插入染色室上緣0.5cm處,細胞靜置沉降10min,將制片艙內液體傾出,然后加沖洗液靜置1min,將沖洗液傾出靜置60min,染色500 μl/次,停留1min。緩沖液2次→蘇木素1次→緩沖液2次→沖洗液2次→EA/OG 1次→沖洗液2次→沖洗液浸泡2min。

1.3.3 免疫組織化學檢測 使用美國生產的Ventana Benchmark XT全自動免疫組織化學儀,對術后病理組織學確診為癌和良性病變的細胞包塊行CK19和Galectin-3免疫組織化學檢測；對術后病理組織學確診為濾泡性腫瘤的細胞包塊行DDIT3和Ki-67免疫組織化學檢測。鼠單抗CK19、Galectin-3和Ki-67購自上海長嘉生物科技有限公司,兔抗DDIT3購自羅氏公司。采用EnVision法染色,二氨基聯苯胺四鹽酸(DAB)顯色。

1.4 統計學方法 采用SPSS18.0統計學軟件對研究數據進行統計分析。計數資料以率(%)表示,采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

本研究兩種方法所制備的細胞蠟塊質量穩定,形狀規則,細胞塊切片具有較規范的切面形狀,HE染色細胞核和細胞質著色良好,連續切片中細胞成分分布均勻；免疫組織化學標志物定位準確,背景干凈。200例行胸腹水TCT檢測患者惡性細胞檢出率為16.0%(32/200),其剩余標本經細胞塊法檢測出的總惡性細胞檢出率為45.5%(91/200),其中A組惡性細胞檢出率53.0%(53/100)高于B組38.0%(38/100),差異具有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 兩種細胞塊制片惡性細胞檢出率比較(%)

3 討論

細胞蠟塊制備是細胞學檢查重要的組成部分,是對細胞學涂片診斷有力的補充,可為提高細胞學診斷正確性提供更多診斷依據,細胞蠟塊的后期處理方法同常規組織學標本,因此切片、染色及免疫組織化學操作步驟與一般組織學切片相同；所制細胞蠟塊同組織學蠟塊一樣,方便長期保存；與涂片相比,細胞學蠟塊可連續性切片,每張切片具有相似的組織結構,便于進行多項檢查結果的評價及比較。細胞塊技術不是一個獨特的技術,20多年以來有很多學者應用,但很少有人對此項技術感到滿意。目前國內也有單位開展了細胞塊技術,歸納起來有如下幾種：離心法、瓊脂法、血漿凝血酶凝集法、雞蛋清法凝集法［4,5］。但上述方法均存在步驟多、耗時、不易操作、甚至有標本量丟失等問題。作者采用細胞塊試劑盒法處理后制作石蠟細胞塊,在滿足細胞涂片所需的標本量之后,將剩余的標本移至玻片上,經過簡單的組織固定過程,即可得到粘附較為緊密的細胞和組織碎片團塊。細胞成分丟失少,這種操作簡單快捷,無需額外的輔助試劑,減少了細胞和組織變形的程度。

對細胞涂片直接行免疫組織化學染色具有一定的優點,包括無需抗原修復,省時,背景著色較淺等,但由于涂片中目標細胞的散在分布,數量稀少,并且在制片過程中造成的細胞破壞以及涂抹玻片數量的限制,存在試劑浪費、對細胞涂片不能多種類抗體標記以及無法正確判讀染色結果等問題,造成檢測結果不穩定［6］。而細胞塊可以被連續或多次切片應用多種抗體進行免疫組織化學等染色,并且細胞塊和白膠片可以長期保存以備日后進行更多的常規檢測,甚至分子方面的檢測,這就彌補了對細胞涂片不能進行多次多種類染色的先天不足［7］。本文提供的病例中,這些細胞塊經過多種抗體染色的聯合應用,便提供了單純細胞涂片所不具有的更為豐富的病理診斷和鑒別診斷信息。

總之,本文介紹的細胞塊制作技術把穿刺細胞學和組織學中標本的固定、處理、石蠟包埋技術有機結合,既保存了穿刺組織良好的細胞形態學特征,又能進一步發掘組織形態學特征,同時便于進行免疫細胞化學染色等輔助檢測的進一步研究之用,實踐證明這是細針細胞學領域的延伸和行之有效的常規技能之一。這種細胞塊技術可以有效地運用于日常細胞學工作中,也易于在各級醫院常規開展。

［1］孫春龍.兩種制片方法在胸腹水細胞學診斷中聯合應用.臨床與實驗病理學雜志,2012,28(1):1291-1292.

［2］張婉儀,羅麗花,劉惠娟,等.胸腹水細胞塊制作技術及應用.臨床醫學工程,2014,21(1):44-45.

［3］劉巖,吳秉銓,鐘鎬鎬,等.瓊脂石蠟雙包埋和免疫細胞化學染色的細胞學應用.診斷病理學雜志,2013,20(3):184-186.

［4］毛瑛玉,楊敏,劉冬戈,等.細胞塊切片免疫細胞化學染色在漿膜腔積液細胞學診斷中的應用.中華病理學雜志,2009 ,38(8): 547-550.

［5］鄧志勇,李海,陳芳,等.超薄液基細胞技術在胸腹水癌細胞檢測中的應用價值探討.現代腫瘤醫學,2010,18(9):1829-1830.

［6］Sriram KB,Relan V,Clarke BE,et al.Diagnostic molecular biomarkers for malignant pleural effusions.Future Oncol,2011,7(6): 737-752.

［7］劉彬,陳汶,任生達,等.液基細胞學剩余標本篩查子宮頸病變中人乳頭狀瘤病毒 DNA 的應用.中華檢驗醫學雜志,2005,28(5):495-497.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.10.019

2016-01-27］

516001 廣東省惠州市中心人民醫院病理科

楊清緒