腦蛋白水解物片劑肽含量測定方法的改進

湯曉樞+陸志英+樊琪俊

摘 要 目的：優化腦蛋白水解物片中肽含量測定方法。方法：采用分子排阻色譜法鑒別腦蛋白水解物片中小分子肽類、高效液相色譜法測定腦蛋白水解物片中肽含量。結果：分子排阻色譜法鑒別小分子肽特異性強；高效液相色譜法測定的各種氨基酸在一定的濃度范圍內與峰面積呈良好的線性關系（r>0.999），平均回收率為98.0%～102.4%。結論：該方法快速、簡便、專屬性強、重復性好， 結果準確可靠， 適用于腦蛋白水解物片的質量控制。

關鍵詞 腦蛋白水解物片 質量控制 肽 分子排阻色譜 高效液相色譜

中圖分類號：R282.74； R927.2； O657.72 文獻標識碼：A 文章編號：1006-1533（2016）03-0076-05

Optimization of a method for the determination of peptide content in cerebroprotein hydrolysate tablets

TANG Xiaoshu*， LU Zhiying， FAN Qijun

（Shanghai Greatwall Pharmaceutical Co. Ltd.， Shanghai 201206， China）

ABSTRACT Objective： To optimize a method for the determination of peptide content in cerebroprotein hydrolysate tablets. Methods： A size-exclusion chromatography method and an HPLC method were used for the identification of peptide and the determination of peptide content in cerebroprotein hydrolysate tablets， respectively. Results： The result of size-exclusion chromatography method had the advantages of high specificity. The standard curve of every amino acid was linear （r>0.999）with average recovery 98.0%～102.4%. Conclusion： This method is simple， accurate， sensitive and reproducible， and can be applied in the quality control of cerebroprotein hydrolysate tablets.

KEY WORDS cerebroprotein hydrolysate tablets； quality control ； peptide； size-exclusion chromatography； HPLC

腦蛋白水解物為從健康豬新鮮大腦組織中提取的一種活性肽類水解物，其作為一種大腦所特有的肽能神經營養物質，通過作用于中樞神經，調節和改善神經元的代謝，促進突觸的形成，誘導神經元的分化，并進一步保護神經細胞免受各種缺血和神經毒素的損害[1-2]。腦蛋白水解物片在臨床上廣泛用于改善失眠、頭痛、記憶力下降、頭暈及煩躁等癥狀，可促進腦外傷后遺癥、腦血管疾病后遺癥、腦炎后遺癥、急性腦梗塞和急性腦外傷的康復。藥理實驗結果顯示，腦蛋白水解物主要藥效成分為小分子肽，以上肽類能通過血腦屏障，促進腦內蛋白質的合成，影響呼吸鏈，具有抗缺氧的保護能力，改善腦內能量代謝，激活腺苷酸環化酶和催化其它激素系統，并提供神經遞質、肽類激素及輔酶前體[3-4]。

腦蛋白水解物片現行的質量標準規定藥品規格為6.5 mg（按氨基氮計算）或14.4 mg（按總氮計算）[5]。在該項國家標準中，只有2項顯色反應作為鑒別反應，并只采用滴定法對產品的總氮、氨基氮含量進行控制，方法落后，專屬性與有效性都較差。缺乏對腦蛋白水解物片中主要藥效成分小分子肽質量控制的科學方法及指標。

本研究參考文獻提高了腦蛋白水解物片質量標準，通過分子排阻色譜法對小分子肽進行鑒別[6-7]，并采用Waters AccQ-Tag衍生法來測定腦蛋白水解物片肽含量[8-10]，制訂出針對主要藥效成分小分子肽合理的質量控制指標。提高了腦蛋白水解物片質量可控性，使制劑各組分達到有效劑量范圍，從而保證療效。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

Agilent 1100液相色譜儀，DAD檢測器、自動進樣器（安捷倫科技中國有限公司）。Waters 2695/2487液相色譜儀，VWD檢測器、自動進樣器（美國Waters公司）。Sartorius BP121S電子天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）。Sartorius BP121S電子天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）。

腦蛋白水解物對照品溶液（批號：140697-200602）、16種氨基酸對照品（批號：624-200104）和D-正亮氨酸對照品（批號：140687-200401）均購自中國藥品生物制品檢定所。腦蛋白水解物片（批號：20131001）為本公司產品。Waters AccQ-Fluor試劑盒（美國Waters公司，氨基酸衍生用）。乙腈和異丙醇為色譜純，水為超純水，磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、乙酸鈉、磷酸均為分析純。

1.2 色譜條件

1.2.1 分子排阻色譜

采用Agilent 1100液相色譜儀和TSK GEL 2000 SWxl 型凝膠色譜柱（7.8 mm×300 mm，5 μm），流動相：磷酸鹽緩沖液（取磷酸氫二鉀10.63 g與磷酸二氫鉀5.31 g，加異丙醇50 ml，加水至約800 ml，用磷酸調節pH至7.0，加水稀釋至1000 ml）。柱溫：30 ℃。檢測波長：280 nm。流速：0.6 ml/min，進樣量10 μl。

1.2.2 HPLC

采用Waters 2695/2487液相色譜儀和Kromasil 100-5 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相A：將乙酸鈉19.05 g溶解于1 000 ml水，用磷酸調pH至5.00；流動相B：60%乙腈溶液。上樣后按表1進行梯度洗脫。柱溫：37.0 ℃。檢測波長：248 nm。流速：1.4 ml/min，進樣量5 μl。

1.3 溶液制備

1.3.1 對照品溶液的制備

取中國藥品生物制品檢定所購得腦蛋白水解物作為對照品溶液。

按表2稱取需測定的16種氨基酸的對照品置于100 ml容量瓶中，以6 mol/L鹽酸5 ml溶解，加水至刻度，搖勻，作為對照品貯備液；精密量取1 ml至100 ml容量瓶中，精密加入內標溶液（2 mg/ml D-正亮氨酸溶液）1 ml，加水至刻度，搖勻，作為氨基酸對照品溶液。

1.3.2 供試品溶液的制備

取腦蛋白水解物片2片，研細，加水10 ml溶解，濾過，作為腦蛋白水解物供試品溶液。

取腦蛋白水解物片20片，研細。精密稱取該粉末0.72 g，置100 ml量瓶中，加1 mol/L鹽酸溶液1 ml和內標溶液1 ml（2 mg/ml D-正亮氨酸溶液），加水稀釋至刻度，濾過，取續濾液作為游離氨基酸含量測定供試品溶液。

精密稱取同批號腦蛋白水解物片粉末0.24 g，置硬質安瓿中，加內標溶液1 ml（2 mg/ml D-正亮氨酸溶液）和鹽酸2 ml，封口，110 ℃水解20 h，放冷，啟封，置蒸發皿中，水浴蒸發至干，加水使殘留物溶解并稀釋至100 ml，作為水解氨基酸含量測定供試品溶液。

1.3.3 空白溶液的制備

取空白輔料（按處方配制，除腦蛋白水解物）適量，研細，加水10 ml溶解，濾過，作為腦蛋白水解物空白溶液。

1.4 氨基酸分析

采用AccQ-Tag氨基酸分析法，分別取對照品溶液、游離氨基酸含量測定供試品溶液、水解氨基酸含量測定供試品溶液衍生后進樣，分別測定腦蛋白水解物片中游離及水解氨基酸含量，計算肽含量（肽含量=水解氨基酸含量-游離氨基酸含量）。

2 結果

2.1 方法學考察

2.1.1 系統適用性試驗

取氨基酸對照品溶液和各供試品溶液，衍生后進行的系統適用性試驗結果見圖1。

從圖1可見，在該色譜條件下，需測定的16種氨基酸均能完全分離，峰形較佳，表明該方法系統適用性好。

2.1.2 線性范圍

取16種氨基酸對照品貯備液，分別稀釋200倍、133倍、100倍、80倍、67倍，配制成一系列濃度的混合對照品溶液，分別取上述對照品溶液衍生后進樣，并計算16種氨基酸的線性回歸方程（表3）。

結果顯示，在該色譜條件下，16種氨基酸均在濃度范圍內與峰面積呈良好的線性關系（r>0.999）。

2.1.3 重復性試驗

取同一批制備的游離氨基酸和水解氨基酸供試品溶液各6份，衍生后測定游離和水解氨基酸的含量，并計算腦蛋白水解物片肽含量（表4）。

肽含量均值為46.81 mg/片，RSD小于2.0%，表明采用該方法測定腦蛋白水解物片肽含量重復性較好，測定結果可靠。

2.1.4 加樣回收試驗

取供試品適量，按照高（120%）、中（100%）、低（80%）三個濃度加入含16種氨基酸的對照品儲備液，分別依法制備加樣回收的游離氨基酸供試品溶液、水解氨基酸供試品溶液，每個濃度各3份。取上述游離和水解加樣溶液衍生后進樣測定，并分別計算加樣回收率（表5）。

結果表明，游離和水解氨基酸含量測定中16種氨基酸的回收率均在98.0%～102.4%范圍內，RSD均小于2.0%，證明本方法回收率結果良好。

2.2 肽鑒別與含量測定

2.2.1 分子排阻色譜法鑒別試驗

將供試品溶液肽色譜圖與對照品溶液的比較，發現供試品溶液特征峰的保留時間與對照品溶液的基本一致。而腦蛋白水解物空白溶液對檢測無干擾（圖2），表明分子排阻色譜法鑒別腦蛋白水解物片中肽的專屬性強。

2.2.2 肽含量測定

取5批次的腦蛋白水解物片制備游離和水解供試品溶液，衍生化后進樣，測定并計算肽含量（表6）。

3 討論

分子排阻色譜法的分離原理為凝膠色譜柱的分子篩機制。凝膠色譜柱的填充劑親水凝膠表面分布著不同尺寸的孔徑，藥物分子進入色譜柱后，它們中的不同組分按其粒徑大小進入相應的孔徑內，粒徑大于凝膠孔徑的分子不能進入填充劑顆粒內部，在色譜過程中不被保留，最早被流動相洗脫出，表現為保留時間較短；小于所有孔徑的分子能自由進入填充劑表面的所有孔徑，在柱子中滯留時間較長，表現為保留時間較長；其余分子則按分子大小依次被洗脫。分子排阻色譜法可以用于高分子化合物，如蛋白質、肽類、核酸等的分離分析。腦蛋白水解物中具有生物活性及藥效作用的成分為小分子肽，分子量在5 000～10 000之間，使用TSK GEL 2000 SWxl 型凝膠色譜柱進行分離，供試品與對照品在相同保留時間有相同的特征峰，顯示其小分子肽類的分子量分布與對照品一致，提供了鑒別腦蛋白水解物中小分子肽類專屬性更好的方式。

目前，常用的小分子肽類含量測定的方法為雙縮脲比色法，其存在靈敏度差，測定結果不精確的缺點。我們對于腦蛋白水解物的成分進行分析，其主要成分為小分子肽類及游離氨基酸，小分子肽是由蛋白質中多種氨基酸以不同組成和排列方式通過肽鍵（也稱酰胺鍵）相互連接形成的化合物。我們采用氨基酸分析方法（HPLC法）來測定腦蛋白水解物片中肽的含量，通過對樣品進行完全的酸水解，測定腦蛋白水解物片中的氨基酸總量，并對腦蛋白水解物片中所含游離氨基酸進行含量測定，將水解后氨基酸總量減去樣品中游離的氨基酸含量，準確的計算腦蛋白水解物片中的肽含量，制定出針對小分子肽含量的合理的HPLC測定方法，快速、準確、專屬性強。

腦蛋白水解物片現行質量標準中規定氨基氮含量為6.5 mg/片，總氮含量為14.4 mg/片，即腦蛋白水解物片中肽的氮含量為7.9 mg/片。而肽類的含氮量一般在14%～18%之間，平均為16%。故可推算出腦蛋白水解物片中含肽約為43.9 ～56.4 mg/片。由表6中的5批測定結果可見，用氨基酸分析方法測定的肽含量在（46.6～54.7） mg/片之間，與原標準相印證，故我們腦蛋白水解物片中肽含量的限度為不少于（40～60） mg/片。

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